桂林市经性传播的HIV-1的流行特征和亚型分析

孔衍琳，张 帅，王雪雯，李赫伟，胡婷婷，蒋 骞，蒋就喜，潘定权，张振开，王海泉，李 林，孙常荣，李敬云，梁 浩，梁冰玉，张 奇

桂林市经性传播的HIV-1的流行特征和亚型分析

孔衍琳1，张 帅1，王雪雯1，李赫伟1，胡婷婷1，蒋 骞1，蒋就喜1，潘定权2，张振开2，王海泉3，李 林4，孙常荣4，李敬云4，梁 浩5，梁冰玉5，张 奇6

目的了解桂林市2008年及以后确诊的经性传播的人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）感染者的流行病学及亚型的分布情况。方法选取样本100例，收集流行病学资料，采集抗凝全血，提取病毒RNA，RT-PCR法行gag基因扩增，对产物进行测序和分析。结果100例样本中男女比例为2.125∶1；青壮年年龄组（20～49岁）患者为54%，＞50岁年龄组患者为45%；职业为农民的患者为40%，学生为6%；初中及以下文化水平患者占69%；经异性和同性性接触途径传播的分别为93%、7%。100例样本最终成功扩增得到61例样本的gag基因序列，CRF01-AE重组亚型48例，CRF07－BC重组亚型8例，B亚型5例。结论应更加重视婚检、孕检的艾滋病抗体筛查；关注老年人群经性接触途径感染艾滋病的现象；采取针对低素质人群的有效防治措施；随着主要传播途径和主要亚型的变化，迫切需要对高危人群进行宣传教育和行为干预以阻断HIV／AIDS的流行和传播。

HIV-1；流行特征；亚型；gag基因

截至2013年底，中国现存活艾滋病（acquired immunodeficiency synodrome，AIDS）患者和HIV感染者约436 817例，死亡136 274例，现存活AIDS患者173 825例，HIV感染者262 992例，疫情十分严峻［1］。根据血清学反应和病毒核酸序列测定结果，HIV被分为1型（HIV-1）和2型（HIV-2），HIV-Ⅰ型又分为诸多亚型，其组内各亚型之间的基因离散率是20%～30%，同一亚型内的基因离散率是7%～20%［2］，我国是世界上发现HIV-1亚型最多的国家之一。2011年桂林市感染现状估计，全人群HIV感染率为0.157%，高于2011年全国艾滋病疫情估计结果中的全人群感染率0.058%；现存成年HIV感染者（15～49岁）4 398例，现存HIV感染者中妇女（15～49岁）1 017例（比例均为23.12%），现存HIV感染者中注射吸毒者的比例为22.269%［3］。笔者对广西壮族自治区桂林地区2008年以后（包括2008年）确诊的AIDS患者和HIV-1感染者的流行特征和HIV-1流行毒株的亚型做了研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 病例资料于2013年9月～2014年5月，在桂林市第三人民医院收集2008年以后（包括2008年）经桂林市疾病预防控制中心（CDC）确诊经性传播的HIV-1患者100例（其病毒载量最好≥1 000 copies／ml），对其进行流行病学问卷调查并采集静脉血10 ml，于6 h内送至实验室进行高速离心分离出血浆，－80℃保存备用。

1.2 HIV-1病毒RNA提取与gag区基因的PCR扩增采用德国Roche公司的病毒RNA提取试剂盒（High Pure Viral RNA Kit），严格按试剂盒说明书提取血浆病毒RNA，用日本TaKaRa公司一步法试剂盒（TaKaRa one step RNA PCR kit）进行RNA逆转录和第一轮PCR，通过巢式PCR，采用日本TaKaRa公司PCR扩增试剂盒（TaKaRa Ex Taq Kit）进行第二轮PCR，gag区PCR扩增引物。见表1。

表1 gag基因片段扩增引物

1.3 序列测定将第二轮PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并在电泳结束后将胶从胶板上去下，置于凝胶扫描成像仪上，与Marker比较，观察目的条带，并将阳性扩增样本的第二轮PCR产物送至北京博迈德公司进行Sanger法测序，gag基因片段测序引物。见表2。

表2 gag基因测序引物

1.4 序列分析使用拉莫斯国家实验室HIV核酸序列库（Los Alamos HIV Database）（http：／／www. HIV.lanl.gov）提供的在线工具Quality Control进行序列校正和裁剪，再用BioEdit软件进行手工校对，用MEGA 5.03软件构建Neighor-joining系统进化树（重复运算1 000次），确定分型及与国际参考株序列进行比对分析，以Bootstrap值＞70%来检验进化树拓扑结构的正确性。所需国际参考株均由美国Los Alamos HIV Detabase提供。

2 结果

2.1 人群分布特征100例HIV患者的样本资料中，男性构成比为0.68（68／100），女性构成比为0.32（32／100），男女比例为2.125∶1（68／32）。青壮年年龄组（20～49岁）患者所占比例最大，为54%（54／100）；＜20岁年龄组患者的构成比为1% （1／100）；＞50岁年龄组患者的构成比为45%（45／100）。职业为农民的患者所占比例最大，为40% （40／100）；职业为离退人员的构成比为11%（11／100）；学生所占构成比为6%（6／100）。初中及以下文化水平患者占69%（68／100），所占比例最大；大专及以上的构成比占9%（9／100）。经异性性接触传播所占的比例最大，为93%（93／100）；同性性传播构成比为7%（7／100）；其他传播途径的样本未采集到。汉族和少数民族的检出率分别为88%（88／100）和12%（12／100）。

2.2 基因分型结果

2.2.1 基因亚型鉴定 100例样本最终成功扩增得到61例样本的gag基因序列，扩增率为61%。经系统树分析显示，此次样本中共发现3种亚型，其中CRF01-AE重组亚型48例（78.69%），CRF07-BC重组亚型8例（13.11%），B亚型5例（8.20%）。见图1。

2.2.2 系统进化分析 GL-gag6331、GL-gag6395、 GL-gag6341、GL-gag6350、GL-gag6504、GL-gag6388、GL-gag6397、GL-gag6344等48株CRF01-AE重组亚型与泰国、非洲、中国AE代表株01-AE.AF.07. 569M.GQ477441、01-AE.TH.91.TN240.L11761、01-AE.CN.05.Fj055.EF036527、01-AE.CN.05.Fj052. EF036528聚在一起。GL-gag6324、GL-gag6339、GL-gag6380、GL-gag6386、GL-gag6322等5株B亚型与泰国代表株B.TH.07.AA040a-WG11.JX447156、B. TH.00.00TH-C3198.AY945710聚在一起。GL-gag6353、GL-gag6351、GL-gag6362、GL-gag6372、GL-gag6335、GL-gag6343等8株CRF07-BC重组亚型与中国代表株07-BC.CN.07.CNGZD.JQ423923、07-BC.CN.97.97CN001-C54.AF286226聚在一起。系统树从系统进化角度进一步证实了桂林各毒株、亚型之间的变异进化关系。见图1。

3 讨论

综合分析对广西及桂林地区HIV-1流行状况的研究［4－7］，经性传播的、2008年及以后确诊的HIV-1在桂林地区的流行情况如下：从性别特征来看，HIV-1感染者中男性仍多于女性，但女性感染人数增加，男女比例下降为2.125∶1，与研究［8］一致。育龄期的女性感染人数增加，应该更加重视婚检、孕检，及早发现感染者，实施夫妻、母婴阻断措施，减少感染机会。从年龄特征来看，20～49岁青壮年仍然为新确认患者人数主体，占新确认感染人数的一半以上。值得关注的是，50岁以上老年患者人数占本次调查研究的近一半，这说明老年人，特别是老年男性的感染比例呈明显上升趋势，其传播途径一般为异性性传播，这一特征与全国和广西报道的情况一致。一方面可能是因为老年男性本身的生理特征，加上空巢老人的精神生活匮乏、孤独、寂寞的心理特征，很容易成为暗娼猎捕的对象；另一方面这些老年人发生商业性行为的对象一般为低档暗娼，对于AIDS的防控知识不了解，也不会选择正确使用安全套等方式防控AIDS，从而成为AIDS感染的高危人群，提示必须对老年人经性接触传播艾滋病的问题加以重视。从职业和文化程度来看，农民所占比例最大，农民及待业人员占本次研究的52%，初中级以下文化程度占69%，这说明2008年及以后确诊的感染人群仍然跟以往的调查研究一样，文化程度比较低，这提示传统的说教、讲解教育方式可能对这部分人群收效甚微，应该探索更多针对这部分人群的有效宣传模式。本研究显示学生和干部职员占的比例分别为为6%和9%，说明并非文化程度越高的群体对AIDS的防范意识就一定强，即存在着学历高、AIDS知晓情况良好的前提下，行为与认知仍然严重分离导致感染的情况，应该继续加大宣传教育的力度；此外，这部分学生几乎全部通过同性性接触而感染，说明学生群体里可能存在这部分特殊人群，应该重点加以宣传教育和行为干预，防范AIDS在这部分特定人群里进一步蔓延。从传播途径特征来看，与以往主要关注吸毒人群的研究不同，本次研究的样本都是性传播人群，且异性性接触传播占绝大多数，同时存在少数同性性接触传播的情况，说明桂林2008年及以后确诊的感染者依然以异性性传播为主要感染途径，性乱人群逐渐成为主要的HIV感染人群。

广西流行的HIV-1毒株比较复杂，研究［9］结果显示，广西流行的亚型按照构成比大小依次为CRF01＿AE、CRF08＿BC、CRF07＿BC、未知重组型、B （B’）亚型、G亚型。本研究以异性性传播占大多数，表明这个人群中亚型多样，主要以CRF01＿AE为其主要流行亚型，这与以往广西CRF01＿AE主要在吸毒人群中流行不同，与研究［10］结果相同，这说明CRF01＿AE已经从吸毒人群向异性性传播感染人群扩散。桂林作为广西北部的重要城市，国际人员往来多，国内人口流动频繁，增加了HIV传播和流行的机会，必须加大对暗娼的打击力度，增强对高危人群和HIV感染者的教育和管理，切断性传播这一主要传播途径，对于全区甚至全国的AIDS控制有重要意义。本研究也存在一定局限，首先，由于样本过于特殊，本研究无法做到随机取样；其次，本研究只采样100例，相对于桂林AIDS庞大的基数来说，样本数量偏少，而且部分样本采集时实际病毒载量比选取样本时CDC提供病毒载量低，无法提取到病毒RNA，从而导致扩增效率偏低。

［1］ 中华人民共和国卫生部，UNAIDS，WHO.中国艾滋病防治工作进展（2013）.［2013－11－11］.www.china aids.org.cn.

［2］ Korber B，Muldoon M，Theiler J，et al.Timing the ancestor of the HIV-1 pandemic strains［J］.Science，2000，288（5472）：1789－96.

［3］ 文小青.2011年广西壮族自治区桂林市艾滋病疫情估计［J］.疾病监测，2012，27（8）：627－30.

［4］ 王 勇，唐振柱，朱秋映，等.广西2009－2011年艾滋病流行特征分析［J］.华南预防医学，2013，39（1）：6－11.

［5］ 简华慧.我国偏远地区艾滋病的防治研究综述［J］.中国医药指南，2013，11（14）：461－3.

［6］ 蒋就喜，李赫伟，周 方，等.桂林市HIV-1流行毒株的基因序列测定和亚型分析［J］.广西师范大学学报（自然科学版），2010，28（2）：91－5.

［7］ 蒋就喜，李赫伟，周方，等.桂北地区HIV-1感染者的HIV-1病毒亚型分布观察［J］，山东医药，2010，50（22）：13－5.

［8］ 杨 艳，周月姣，孟 琴.广西第二轮全国艾滋病综合防治示范区艾滋病流行特点分析［J］.广西医学，2014，36（9）：1258－61.

［9］ 陈立力.云南和广西HIV-1流行毒株的基因变异和分子进化研究［D］.中国人民解放军军事医学科学院，2011.

Epidemiology and gene analysis of HIV-1 infections in Guilin who infected by sexually transmission

Kong Yanlin，Zhang Shuai，Wang Xuewen，et al
（Dept of Infectious Diseases，The Affiliated Hospital of Guilin Medical College，Guilin 541001）

ObjectiveTo determine the epidemiological situation of confirmed HIV-1 infections in Guilin after 2008 who were infected by sexually transmission，and to understand the distribution of HIV-1 subtypes.MethodsTo make epidemiological survey on the 100 confirmed HIV-1 infections，extract HIV-1 RNA from their whole blood and amplified by RT-PCR.HIV-1 gag gene was sequenced directly from the PCR product.ResultsIn the chosen patients，male to female ratio was 2.125∶1.Patients aged≥20 and≤49 years old accounted for 54%in total，and patients aged 50 years old or older accounted for 45%.Farmers accounted for 40%and students accounted for 6%.Patients with education level of junior middle school or below accounted for 69%.The proportions which were transmitted through heterosexual and homosexual contact were 93%and 7%respectively.61 specimens were gained in 100 specimens，then sequence analysis showed that there were 3 HIV-1 subtypes，CRF01-AE（48 samples），B （5 samples），CRF-07BC（8 samples）.ConclusionThe more attentions should be paid to the HIV／AIDS antibody screening in marriage and pregnancy inspection，focus on HIV／AIDS infection though sexual transmission in elderly people，and more effective ways to prevent HIV／AIDS infection for the population with poor education level should be explored.With the change of the main transmission and subtype，the more education and behavioral interventions should be done to prevent the spread of HIV／AIDS.

HIV-1；epidemiological characteristics；subtype；gag gene

R 373.51

A

1000－1492（2015）07－0966－04

2015－03－10接收

国家自然基金（编号：81273137）；国家科技重大专项课题（编号：2012ZX10001-002）；广西本级技术研究与开发项目（桂财教［2012］98号）；桂林市科学研究与技术开发项目（编号：20130120-18）；广西壮族自治区研究生教育创新计划资助项目（编号：YCSZ2013101）

1桂林医学院附属医院感染性疾病科，桂林 541001

2桂林市疾病预防控制中心，桂林 541001

3桂林市传染病医院，桂林 541002

4军事医学科学院微生物流行病研究所，北京 100071

5广西医科大学公共卫生学院，南宁 530021

6临沂市沂水中心医院，临沂 276000

孔衍琳，女，硕士研究生；蒋就喜，男，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：gljiangjx ＠sohu.com