高效液相色谱法测定山楂精降脂片中齐墩果酸和熊果酸含量

林轶男，金慧子，苏 娟（．上海交通大学药学院，上海0040；．第二军医大学药学院天然药物化学教研室，上海00433）

高效液相色谱法测定山楂精降脂片中齐墩果酸和熊果酸含量

林轶男1，金慧子1，苏 娟2（1．上海交通大学药学院，上海200240；2．第二军医大学药学院天然药物化学教研室，上海200433）

目的建立高效液相色谱法（HPLC）测定山楂精降脂片中齐墩果酸和熊果酸的含量，有效地控制产品质量。方法采用Agilent Zorbax SB C18柱（250 mm×4．6 mm，5μm），以甲醇-0．06 mol／L乙酸铵（85∶15）为流动相，流速为0．8m l／min；检测波长为210 nm；柱温为25℃。结果齐墩果酸和熊果酸分别在0．124～2．48μg（r＝0．999 7）和0．498～9．96μg（r＝0．999 8）范围内与其峰面积呈良好线性关系。测得齐墩果酸平均回收率为96．9%，RSD为1．26%；熊果酸平均回收率为100.4%，RSD为2．6%。结论山楂精降脂片质量稳定，质控方法简便、准确，结果可靠、重现性好。

山楂精降脂片；齐墩果酸；熊果酸；高效液相色谱法

山楂精降脂片（Shanzhajing Jiangzhi tablet）是福建汇天生物药业有限公司生产的以山楂提取物为单一原料制成的纯中药制剂，是降血脂的良药。原标准收载于1994年版《中华人民共和国卫生部药品标准・中药成方制剂》第九册（标准号为WS3-B-1687-94）。原标准中含量测定采用紫外分光光度法测定无水槲皮素的含量，该方法专属性差，对山楂精降脂片的质量控制意义不大。事实上三萜类成分为山楂精降脂片中降血脂的主要活性成分［1-3］，而齐墩果酸和熊果酸都被广泛证实具有降脂、降压、抗肿瘤、抗肝炎等作用。为了更好地控制山楂精降脂片的内在质量，笔者制定了同时测定山楂精降脂片中齐墩果酸和熊果酸含量的HPLC方法，提高完善了山楂精降脂片的检测标准，对产品的质量控制和保证用药安全具有积极意义。

1 仪器与试药

1．1仪器 Agilent HP-1100系列高效液相色谱仪，包括在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、可变波长检测器、二极管阵列检测器。Sartotius BP211D型电子天平（德国赛多利斯公司）。

1．2试药 齐墩果酸对照品、熊果酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110709-200505，110742-200516，纯度≥98%）。山楂精降脂片（福建汇天生物药业有限公司，批号：120403、130201、130202、130203、130204、130103、130302、130602、130901）。甲醇（J．T Baker，质谱纯），乙酸铵（Anaqua Chemicals Supply，质谱纯），水为M illi-Q超纯水。

2 方法与结果

2．1色谱条件 色谱柱Agilent Zorbax SB C18柱（250 mm×4．6 mm，5μm）；以甲醇-0．06 mol／L乙酸铵（85∶15）为流动相；流速为0．8 m l／m in；检测波长为210 nm；柱温为25℃；进样量5μl。

2．2溶液的制备①对照品溶液：取齐墩果酸对照品和熊果酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1m l含齐墩果酸0．1mg和熊果酸0．5mg的混合溶液，即得。②供试品溶液：取本品10片，剥去糖衣，研细，取约0．5 g，精密称定，精密加入甲醇30 m l，超声提取30 m in后，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，用微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。③空白对照溶液：因山楂精降脂片是以山楂提取物为单一原料制成的纯中药制剂，所以使用甲醇溶液作为空白对照。

2．3系统适用性试验 分别取供试品溶液、对照品溶液、空白对照溶液，按“2．1”项色谱条件，进样5μl。齐墩果酸、熊果酸的保留时间分别为24．239、25．742 min。理论塔板数均＞4 000，两色谱峰分离度为1．54，达到基线分离，且空白对照无干扰，结果见图1。

图1 山楂精降脂片HPLC色谱图

2．4线性关系考察 精密称取齐墩果酸对照品3．10 mg，熊果酸对照品12．45 mg，置25 m l量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取上述对照品溶液各1、2、4、6、8、10、12、14、20μl，按“2．1”项色谱条件进样，测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，齐墩果酸和熊果酸的质量（mg）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。齐墩果酸标准曲线为Y＝455.813 X＋12．367，r＝0．999 7；熊果酸标准曲线为Y＝433.59 X＋25.099，r＝0．999 8。结果表明齐墩果酸在0．124～2．48μg范围内、熊果酸在0．498～9．96μg范围内呈良好线性关系。

2．5精密度试验 精密称取齐墩果酸对照品3．10 mg，熊果酸对照品12．45 mg，置25 m l量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，按“2．1”项色谱条件进样5μl，连续进样6次。测得齐墩果酸、熊果酸峰面积积分值的RSD分别为1．43%和0．34%。结果表明精密度良好。

2．6重复性试验 取同一批号的样品（山楂精降脂片批号：130901）40片，去糖衣，精密称重，每片片芯重106.62 mg。研细，分别精密称重0．5 g，共称取6份，按“2．2”项下方法配成供试品溶液，按“2．1”项下的色谱条件进样，测得齐墩果酸的平均含量为0.633 mg／片，RSD为1.63%；熊果酸的平均含量为3.574 mg／片，RSD为0.8%。结果证明此方法重现性良好。

2．7稳定性试验 取同一供试样品（山楂精降脂片批号：130901）10片，去糖衣，精密称重，研细，精密称重0．5 g，按“2．2”项下方法配成供试品溶液，按“2．1”项下的色谱条件，分别于提取后0、1、2、4、6、8、10、12、24 h，进样5μl，测得齐墩果酸和熊果酸的峰面积的RSD分别为2.57%和1.37%。结果表明，供试品溶液在24 h内稳定。

2．8加样回收率试验 取已知含量的山楂精降脂片样品（批号：130901）40片，去糖衣，精密称重，每片片芯重106.62 mg。研细，各精密称定样品约0.25 g，共称取6份，分别置于30 m l量瓶中。分别精密加入浓度为1．5 mg／m l的齐墩果酸对照品溶液1m l和浓度为8．47mg／m l的熊果酸对照品溶液1 m l，加入甲醇适量。按“2．2”项下方法配成供试品溶液，按“2．1”项下的色谱条件，进样5μl，测得其含量，分别计算回收率，结果表明齐墩果酸平均回收率为96．9%，RSD为1．26%；熊果酸平均回收率为100.4%，RSD为2．6%，见表1。

2．9样品含量测定 取山楂精降脂片样品9批，按“2．2”项下方法配成供试品溶液，测定其含量，按外标一点法计算齐墩果酸和熊果酸含量，结果见表2。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）

表2 样品中齐墩果酸、熊果酸的含量（n＝2）

3 讨论

3．1指标性成分的选择 山楂中主要含有黄酮类、有机酸类和三萜类成分。而原标准采用的含量测定方法是以无水槲皮素作为指标［4］，采用紫外分光光度法检测样品中的总黄酮含量。所以我们首先采用液质联用、对照品比对等方法研究了山楂精降脂片中含有的黄酮类成分，结果发现山楂提取物中并不含有槲皮素，且文献报道的金丝桃苷［5］、牡荆素等常见的黄酮类化合物在山楂精降脂片中也检测不到。故黄酮类物质不适合作为山楂精降酯片含量测定的指标性成分。而三萜类成分作为山楂中另一类主要成分，有广泛的生物活性。其中，齐墩果酸和熊果酸是降血脂、降血压的活性成分［2-4］，且两者是已确知的山楂三萜类代表性化学成分。2010版《中国药典》［6］山楂药材的鉴别项采用的就是以熊果酸为对照品的薄层色谱法，詹学雄等［7］选取了熊果酸作为山楂精降脂片含量测定的指标性成分。齐墩果酸和熊果酸作为同分异构体，结构相近，药理活性相似，在山楂精降脂片中同时存在，且含量较高，所以我们认为，将两者一起作为含量测定的指标性成分更合理、可靠。

3．2提取溶剂与提取方法考察 在样品的前提取处理中，对水、乙醇、乙酸乙酯、甲醇等提取溶剂进行了考察，结果表明，甲醇作为提取溶剂提取率最高。对冷浸法、热回流提取法、以及超声处理法进行了考察，结果表明，超声处理法效果较理想，而且操作简单易行。此外，对超声时间进行了考察，证明超声处理30 min，即可将有效成分提取完全。

3．3色谱条件选择 齐墩果酸和熊果酸是互为同分异构体，结构非常相似，分离存在一定困难。要将两者分开，色谱条件的选择非常重要。根据文献报道，我们试验了不同的流动相系统：甲醇-水-冰醋酸-三乙胺［8］、甲醇-水-磷酸［9］、甲醇-四丁基溴化铵-三乙胺［10］和乙腈-甲醇-水-乙酸胺［11］系统等。结果表明，乙腈-甲醇-水-乙酸胺系统分离效果较好，在此基础上最终确定甲醇-0．06 mol／L乙酸铵（85∶15）为流动相。考察了4种不同型号的色谱柱对供试品分离效果的影响，包括AGT Venusil XBPC18（250 mm×4．6 mm，5μm）；Intersil ODS-3 C18（250 mm×4．6 mm，5μm）；Agilent extend C18（250 mm×4．6 mm，5μm）和Agilent Zorbax SB C18（250mm×4．6mm，5μm）。结果表明，用Agilent Zorbax SBC18柱能更好地分离山楂精降脂片中的成分，而且指标性成分齐墩果酸峰和熊果酸峰峰形较好，理论板数较高，所以选用Agilent Zorbax SB C18柱进行含量测定。之后又进一步考察了流动相流速和温度的变化对分离效果的影响，结果表明柱温为25℃时，甲醇-0．06 mol／L乙酸铵（85∶15）的流动相在流速为0．8 m l／m in的情况下，齐墩果酸和熊果酸的分离效果最好。

3．4检验波长选择 在实验中，对齐墩果酸和熊果酸对照品溶液进行DAD全波长扫描，测得齐墩果酸和熊果酸的最大吸收波长为210 nm。

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Determ ination of oleanolic acid and ursolic acid in Shanzhajing Jiangzhi tablet by HPLC

LIN Yinan1，JIN Huizi1，SU Juan2（1．School of Pharmacy，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240，China；2．Department of Phytochem istry，School of Pharmacy，Second M ilitary Medical University，Shanghai200433，China）

ObjectiveTo establish the quality standard for Shanzhajing Jiangzhi tablet by HPLC．MethodsSamples were analyzed on a Agilent Zorbax SB C18column（250mm×4．6mm，5μm）w ithmethanol and 0．06mol／L ammonium acetate（85∶15）asmobile phase at the flow rate of 0．8 m l／m in．The wavelength and column temperature were set at 210 nm and 25℃，respectively．ResultsThe calibration curve showed a good linear relationship w ithin the range of 0．124-2．48μg for oleanolic acid（r＝0．999 7）and 0．498-9．96μg for ursolic acid（r＝0．999 8）．The average recovery ratio of the oleanolic acid and ursolic acid were 96．9%（RSD＝1．26%）and 100.4%（RSD＝2．6%），respectively．ConclusionThemethod was proved to be good at evaluation effectiveness and practicality．

Shanzhajing Jiangzhi tablet；oleanolic acid；ursolic acid；HPLC

R927

A

1006-0111（2015）05-0448-04

10．3969／j．issn．1006-0111．2015．05．018

2014-07-09

2014-11-07

［本文编辑］ 顾文华

林轶男，硕士研究生．Tel：18616634566，E-mail：linyinan1989＠gmail．com

金惠子，副教授，硕士生导师．研究方向：天然药物化学．Tel：（021）34205989；E-mail：kimhz＠sjtu．edu．cn