莱菔硫烷协同氯化锂对创伤性脑损伤大鼠神经保护作用研究

王朝晖 娄晓辉 余一骏 郑海军

[摘要] 目的 探讨莱菔硫烷协同氯化锂对创伤性脑损伤大鼠神经保护作用。 方法 参照feeney法自由落体致伤法制作创伤性脑损伤模型，大鼠分为对照组、模型组、SFN组及协同组，每组各15只，对照组不进行撞击实验，SFN组术后每日给予莱菔硫烷腹腔注射，协同组给予莱菔硫烷与氯化锂腹腔注射，模型组每日腹腔注射等量生理盐水，比较术后1 d、3 d、5 d、7 d各组大鼠神经功能缺失程度评分（mNSS）及术后7 d各组大鼠脑组织含水量、脑组织HE染色结果以及脑组织中SOD活性、IL-6、TNF-α、MDA水平。 结果 模型组、SFN组、协同组与对照组比较，各时间点mNSS评分均显著升高（P<0.05）；术后5 d、术后7 d，SFN组及协同组大鼠mNSS评分显著低于模型组（P<0.05），且协同组mNSS评分显著低于SFN组（P<0.05）；术后7 d，对照组大鼠脑组织含水量为（69.29±2.06）%，模型组为（75.40±1.73）%，SFN组为（73.08±1.06）%，协同组为（71.27±1.52）%。各组大鼠脑组织HE染色结果显示，SFN组及协同组其神经细胞的损伤较模型组明显减轻，细胞坏死有所减少，且以协同组神经细胞损伤减轻最为显著。模型组、SFN组、协同组与对照组比较，SOD活性显著下降（P<0.05），IL-6、TNF-α、MDA水平显著上升（P<0.05）；SFN、协同组与模型组比较，SOD活性显著上升（P<0.05），IL-6、TNF-α、MDA水平显著下降（P<0.05），且协同组IL-6、TNF-α水平显著低于SFN组（P<0.05）。 结论 莱菔硫烷协同氯化锂对创伤性脑损伤大鼠具有显著的神经保护作用，其作用机制可能与减轻大鼠脑水肿、神经细胞损伤、抑制氧化应激以及炎症因子的释放有关。

[关键词] 莱菔硫烷；氯化锂；创伤性脑损伤；神经保护

[中图分类号] R651.15 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）19-0026-04

创伤性脑损伤（traumtic brain injury，TBI）是一种病情严重的机体中枢神经系统损伤，同时也是目前导致青壮年死亡以及致残的一个主要病因[1]。TBI能够直接破坏大脑神经细胞以及脑血管结构，导致患者神经功能出现严重的损害，TBI激发的脑水肿、神经炎症反应、血-脑屏障通透性改变以及神经细胞凋亡等病理变化可进一步加重对机体脑组织的损害，因此改善TBI患者的预后一直是广大研究者共同关注的课题[2]。莱菔硫烷（sulforaphane，SFN）是一种异硫氰酸盐，主要存在于十字花科植物当中，其中以西兰花的含量最多[3]。近年来，关于SFN抗癌以及细胞保护性能已经成为当前研究的热点；而锂盐作为一种抗抑郁-躁狂症的药物在临床中应用，近些年来[4，5]，通过体内、体外实验研究均表明锂盐能够有效抑制各种因素所导致的神经细胞凋亡。对于莱菔硫烷联合锂盐对脑损伤作用的研究，目前尚无相关报道。本研究探讨莱菔硫烷协调氯化锂对创伤性脑损伤大鼠神经保护作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择清洁级Wistar雄性大鼠60只，实验动物由重庆医科大学实验动物中心提供。分笼进行饲养，给予大鼠自由进食与自由饮水，制备脑创伤模型前12 h禁食。

1.2 主要仪器与试剂

低速离心机（北京医用离心机厂）；Olympus光学显微镜（日本Olympus公司，IX-71）；牙科台式电钻（宁波医疗器械公司）；石蜡包埋机（德国Leica公司）；恒冷冰冻切片机（德国Leica公司）。

莱菔硫烷（美国Calbiochem公司）；氯化锂（广东西陇化工厂提供，分析纯）；SOD检测试剂盒（南京建成试剂公司）；MDA检测试剂盒（南京建成试剂公司）；IL-6检测试剂盒（上海丰翔生物科技有限公司）；TNF-α（上海丰翔生物科技有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠TBI模型 参照feeney法[6]自由落体致伤的原理制备中度TBI大鼠模型。使用腹腔注射水合氯醛（10%，300 mg/kg）麻醉，待麻醉满意后，将大鼠仰卧固定，头顶部备皮，使用常规碘伏消毒，沿大鼠正中线切开头皮约2.5 cm，将骨膜剥离，暴露出右顶骨。使用牙科台式电钻于中线右侧旁2.5 mm、冠状缝后1.5 mm处钻一个直径约为5 mm的骨窗，注意保持硬脑膜的完整，以0.048 N·s（20 g重锤、30 cm高度）的冲击力撞击右侧脑部中央前回皮层，然后再使用骨蜡将钻孔封闭，缝合切口，消毒。打击有效的标准为撞杆打击之后，能够保证硬脑膜的完整性，并且出现局部的脑组织膨隆。术后给予大鼠4万单位的硫酸庆大霉素肌肉注射，以預防感染发生。对照组大鼠接受同样的手术操作，但是并不进行冲击处理。剔除造模不成功或者意外死亡的大鼠，然后用同一批次的大鼠补足。

1.3.2 分组及给药方法 将60只大鼠分为4组，每组15只，分别为对照组、模型组、SFN组、协同组。术后即刻，SFN组给予5 mg/kg SFN腹腔注射，协同组给予5 mg/kg SFN以及30 mg/kg氯化锂腹腔注射，对照组给予等体积的生理盐水腹腔注射，之后每天注射1次，共注射5 d。

1.4 评价指标

1.4.1 神经功能恢复评价 采用改良神经功能缺失程度评分（modified neurological severity score，mNSS）标准对各组大鼠神经功能进行评分。各组大鼠均在术后1 d、3 d、5 d、7 d通过感觉、运动、反射活动以及平衡木测试等对大鼠的神经功能进行评分，比较各组大鼠不同时间的神经功能总分，总分最低为0分，最高为18分，分数越低则表示大鼠的神经功能恢复越好。

1.4.2 脑组织含水量测定 实验动物术后第7天，每组大鼠中任取5只，腹腔注射10%水合氯醛2 mL过量麻醉，将其采用断头法处死，以打击灶作为中心，取大鼠损伤侧大约500 mg脑组织，去除凝血后，用冰冷的生理盐水将脑组织表面的血迹冲洗干净，然后用滤纸吸取表面残余的水分，测量其湿重，然后将其置于60℃的烘箱内烘烤96 h，取出后称量其干重，计算各组大鼠脑组织含水量=（湿重-干重）/湿重×100%。

1.4.3 脑组织HE染色 各组大鼠分别于术后7 d随机抽取5只大鼠，按照上述方法处死，取其脑组织，取出小脑以及低位脑干，以损伤中心为标准，冠状位切开脑组织，然后立即浸入福尔马林溶液当中固定48 h，常规石蜡包埋。HE染色步骤：石蜡切片（厚度为4 μm）→二甲苯脱蜡→梯度酒精脱水→蒸馏水洗→苏木素染细胞核→蒸馏水洗→盐酸酒精分化→氨水细胞核返蓝→伊红染细胞浆→梯度酒精脱水→二甲苯透明→封片→观察、拍照。

1.4.4 脑组织SOD活性、IL-6、TNF-α以及MDA含量测定 术后7 d按照上述方法每组处死5只大鼠，取其脑组织，用生理盐水冲洗后，吸取表面水分，取打击灶为中心的脑组织约220 g，用电子天平精确测量重量后加入约9倍体积的PBS，制作成损伤大脑皮层的匀浆，并记录匀浆总体积（mL）。将其离心20 min（4000 r/min），取其上清液，分装后置于-80℃冰箱内备用检测。各组大鼠脑组织SOD活性、IL-6、TNF-α以及MDA含量测定参照试剂盒使用说明书进行。

1.5 统计学分析

采用SPSS 22.0统计学软件对本研究数据结果进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，两组比较采用t检验，多组比较采用方差分析，检验水平为α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能恢复评分（mNSS）比较

造模后可导致大鼠出现神经功能缺失，且术后1 d以及术后3 d大鼠神经功能的缺失最为严重，模型组、SFN组、协同组与对照组比较，各时间点mNSS评分均显著升高（P<0.05）；术后5 d、术后7 d，SFN组以及协同组大鼠mNSS评分显著低于模型组（P<0.05），且协同组mNSS评分显著低于SFN组（P<0.05）。见表1。

表1 各组大鼠神经功能恢复评分（mNSS）比较（x±s，分）

注：与同期对照组比较，*P<0.05；与同期模型组比较，#P<0.05；与同期SFN组比较，△P<0.05

2.2 各组大鼠脑组织含水量比较

术后7 d，对照组大鼠脑组织含水量为（69.29±2.06）%，模型组大鼠脑组织含水量为（75.40±1.73）%，SFN组大鼠脑组织含水量为（73.08±1.06）%，协同组大鼠脑组织含水量为（71.27±1.52）%。见图1。

2.3 各组大鼠脑组织HE染色

各组大鼠脑组织HE染色见图2，对照组大鼠脑组织无损伤，显示其皮层神经结构完整，脑组织细胞数量多，可见明显的核仁；模型组大鼠损伤区脑皮层结构不完整，且无明显核仁，在损伤中心可见细胞溶解、坏死以及软化灶的形成；SFN组以及协同组神经细胞的损伤较模型组明显减轻，细胞坏死有所减少，在创伤周边可以看到新生增殖的组织，且以协同组神经细胞损伤减轻最为显著。

图2 各组大鼠脑组织HE染色表现（×400）

（①对照组；②模型组；③SFN组；④协同组）

2.4 各组大鼠脑组织SOD、IL-6、TNF-α以及MDA水平比较

模型组、SFN组、协同组与对照组比较，SOD活性显著下降（P<0.05），IL-6、TNF-α、MDA水平显著上升（P<0.05）；SFN、协同组与模型组比较，SOD活性显著上升（P<0.05），IL-6、TNF-α、MDA水平显著下降（P<0.05），且协同组IL-6、TNF-α水平显著低于SFN组（P<0.05）。见表2。

3 讨论

创伤性脑损伤（TBI）是临床中导致患者死亡和致残的一个主要疾病，严重的TBI患者大多遗留有认知记忆功能的障碍以及感觉、运动功能的缺损。大量的相关研究显示[7]，脑损伤后所继发的脑水肿、神经细胞凋亡、神经炎症反应等均可能再次加重脑组织损伤，甚至导致患者死亡。迄今为止，除常规的手术缓解患者脑水肿所引起的颅内压升高外，仍然没有有效的方法提高患者的神经功能恢复。大量研究结果显示[8，9]，机体脑损伤后，产生出大量的氧自由基，一方面蛋白质、脂质以及DNA等大分子物质发生氧化损伤直接破坏细胞膜以及其他细胞的结构，另一方面则刺激细胞因子以及相关粘附因子的表达，从而介导炎症反应以及免疫反应，导致脑组织损伤加重；此外，通过抑制线粒体功能等间接途径，氧自由基能够激动凋亡信号通路，从而引起细胞凋亡。氧自由基在继发性脑损伤病理机制当中起到了非常重要的作用，因此，抑制氧化应激反应及清除氧自由基可能是治疗TBI的一个重要思路。

莱菔硫烷（SFN）是一种异硫氰酸盐，主要存在于十字花科植物当中，研究显示[10]，SFN具有显著的抗肿瘤及抗氧化生物学特性。近些年来，随着对莱菔硫烷研究的不断深入，发现莱菔硫烷对脑出血、脑部严重、急性肾功能衰竭、心脏缺血再灌注等均具有良好的保护作用[11，12]。目前体内外实验结果显示，莱菔硫烷能够有效缓解机体由于氧化应激对组织以及细胞的损伤，是一种具有良好前景的抗氧化剂。

近些年来，锂对于脑缺血的保护作用受到了研究者的关注，已有研究证实氯化锂能够有效减轻由于沙土鼠前脑缺血后导致的海马区延迟性神经元死亡[13]。Chuang等[14]对大鼠局灶性脑缺血模型研究中发现，皮下注射（0.5～3.0）mEq/kg氯化锂能够有效减少脑缺血后大鼠脑梗死的体积，且呈剂量依赖性。刘安民等研究显示[15]，氯化锂对于神经细胞的保护作用可能与上调HSP70蛋白、抑制谷氨酸诱导的MAPL激活有关。针对莱菔硫烷与氯化锂不同的神经保护作用机制，猜想二者联合运用是否具有协同作用，故本研究探讨莱菔硫烷协同氯化锂对TBI大鼠的神经保护作用。

本研究结果显示，术后SFN组大鼠以及协同组大鼠其mNSS评分较模型组显著降低，且协同组显著低于SFN组，表明莱菔硫烷能够对TBI大鼠起到显著的神经保护作用，且SFN与氯化锂联合运用，其神经保护作用更为显著，提示二者对TBI大鼠神经保护具有协同作用。从脑组织含水量来看，术后7 d各TBI大鼠脑组织含水量增加，而SFN组、协同组脑组织含水量较模型组有所降低，且协同组低于SFN组；从脑组织HE染色结果来看，运用SFN治疗以及协同治疗后，能够有效减轻TBI大鼠神经细胞的损伤，且协同组作用更为显著；從氧化应激以及炎症因子水平来看，模型组、SFN组、协同组与对照组比较，SOD活性显著下降（P<0.05），IL-6、TNF-α、MDA水平显著上升（P<0.05）；SFN、协同组与模型组比较，SOD活性显著上升（P<0.05），IL-6、TNF-α、MDA水平显著下降（P<0.05），且协同组IL-6、TNF-α水平显著低于SFN组（P<0.05），表明SFN协同氯化锂能够有效减轻TBI大鼠的脑水肿、减轻大鼠神经细胞损伤、清除氧自由基、降低炎症因子水平。

综上所述，莱菔硫烷协同氯化锂对创伤性脑损伤大鼠具有显著的神经保护作用，其作用机制可能与减轻大鼠脑水肿、神经细胞损伤，抑制氧化应激以及炎症因子的释放有关，而具体的作用通路还需要进一步深入研究。

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（2015-01-27）