氯化锂联合hUC-MSCs移植对阿尔茨海默病小鼠的治疗作用

孟　楠，马珊珊，王欣欣，姚　宁，邢　衢，宋及时，黄团结，关方霞1,#

1)郑州大学第一附属医院干细胞研究室 郑州450052　2)郑州大学生命科学学院干细胞研究室 郑州 450001



氯化锂联合hUC-MSCs移植对阿尔茨海默病小鼠的治疗作用

孟楠1)，马珊珊2)，王欣欣1)，姚宁2)，邢衢2)，宋及时2)，黄团结2)，关方霞1,2)#

1)郑州大学第一附属医院干细胞研究室 郑州4500522)郑州大学生命科学学院干细胞研究室 郑州 450001

关键词氯化锂；Wnt/β-catenin通路；干细胞移植；阿尔茨海默病；小鼠

摘要目的：研究氯化锂(LiCl)联合人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)移植对阿尔茨海默病小鼠(APP+转基因小鼠)的干预作用。方法：PCR鉴定为APP+转基因小鼠40只随机分为4组：APP+组、hUC-MSCs移植组、LiCl注射组、联合处理组(LiCl注射+hUC-MSCs移植)。处理1个月后，Morris水迷宫检测小鼠的认知水平，酶标仪法和分光光度法检测小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量，qRT-PCR和Western blot法检测小鼠海马组织中Wnt/β-catenin通路相关因子的表达。结果：与APP+组比较，LiCl注射组APP+小鼠逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增多，平台所在象限停留时间延长，MDA含量下降，小鼠海马组织中β-catenin、c-Myc mRNA和蛋白表达量增加，GSK-3β mRNA和蛋白表达量降低(P均<0.05)； hUC-MSCs移植可使APP+小鼠血清中SOD活性升高(P均<0.05)，其他指标的变化与LiCl注射组相同；LiCl注射联合hUC-MSCs移植对平台所在象限停留时间、MDA含量、c-Myc蛋白表达的影响具有协同效应(P<0.05)。结论：LiCl联合 hUC-MSCs移植对APP+转基因小鼠具有明显的治疗作用。

Effect of lithium chloride combined with hUC-MSCs transplantation on Alzheimer's disease mouse

MENGNan1),MAShanshan2),WANGXinxin1),YAONing2),XINGQu2),SONGJishi2),HUANGTuanjie2),GUANFangxia1,2)

1)StemCellLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500522)StemCellLaboratory,SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

Key wordslithium chloride;Wnt/β-catenin pathway;stem cell transplantation;Alzheimer′s disease;mouse

AbstractAim: To research the effects of lithium chloride(LiCl) combined with human umbilical cord mesenchymal stem cells(hUC-MSCs) transplantation on Alzheimer's disease model mice(APP+transgenic mice) and the potential mechanism. Methods: A total of 40 APP+mice identified by PCR were allocated into 4 groups randomly：APP+group, hUC-MSCs group, LiCl group and LiCl combined with hUC-MSCs group.After 1 month, all mice were to study the learning and memory ability by Morris water maze test, the activity of superoxide dismutase(SOD) and the concentration of malonaldehyde(MDA) in the serum were determined by microplate spectrophotometer and ultraviolet spectrophotometer, the mRNA and proteins associated with Wnt/β-catenin pathway were detected by qRT-PCR and Western blot. Results: Compared with APP+group, the escaping latency was significantly shorter, the times of crossing platform was significantly increased and the time spent in the platform quadrant was significantly longer，MDA concentration was decreased,the expressions of β-catenin and c-Myc mRNA and proteins in the hippocampus tissue were increased, while GSK-3β mRNA and proteins expression was decreased in LiCl group; in hUC-MSCs group,the changing trend of the indexes mentioned above were similar with the LiCl group, and the activity of SOD in serum increased; hUC-MSCs transplantation and LiCl had synergistic effects on the time spent in the platform quadrant, MDA concentration and c-Myc protein expression(P<0.05). Conclusion: LiCl combined with hUC-MSCs transplantation has therapeutic effects on APP+transgenic mice.

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是与年龄直接相关的痴呆类型，影响着全世界约3 500万人口，预计到2050年患者将达到1亿[1]。因此，AD是世界范围内亟待解决的健康问题[2]。随着干细胞在再生医学中的应用，关于干细胞治疗AD的研究也越来越多。人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)具有取材方便、低免疫原性、伦理学争议小[3]等特点。前期研究[4]发现hUC-MSCs移植可以明显改善APP+转基因小鼠的学习记忆能力，但其分子机制尚不明确。研究[5]显示激活Wnt/β-catenin通路可以促进成人脑内神经发生，调节突触形成与发育。氯化锂(lithium chloride，LiCl)是Wnt/β-catenin通路激活剂，可以直接抑制GSK-3β，促进β-catenin在细胞内累积[6]。此外，LiCl作为治疗双相情感障碍最重要的药物[7]，在临床应用已有100多年，其安全性已得到有效证实。因此，该研究以APP+转基因小鼠为模型，观察LiCl联合hUC-MSCs移植对AD的治疗作用，并初步探讨其分子机制。

1材料与方法

1.1试剂及仪器hUC-MSCs由课题组前期冻存。DMEM/F12培养基购自宝信生物科技有限公司，胎牛血清购自美国Gemini公司，LiCl购自美国Sigma公司，DNA小提试剂盒、Trizol、反转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司，APP、GSK-3β、β-catenin、c-Myc引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，兔抗人GSK-3β、β-catenin、c-Myc多克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，血清SOD活性测定试剂盒及血清MDA含量测定试剂盒购自南京建成生物公司。

1.2APP+转基因小鼠的来源及鉴定4月龄清洁级APP695v717I转基因小鼠购自中国协和医科大学动物所。剪取小鼠尾巴约0.5 cm，用DNA小提试剂盒提取DNA，PCR扩增APP基因(扩增引物为：5’-CCCTGAACCTGAAACATAAAAT-3’和5’-GC TACGAAAATCCAACCTACAA-3’，产物大小284 bp)，琼脂糖凝胶电泳。经PCR鉴定，共获得40只APP+小鼠。

1.3实验分组及处理将APP+转基因小鼠随机分为APP+组、hUC-MSCs移植组、LiCl注射组、联合处理组，每组10只。hUC-MSCs移植组：APP+小鼠尾静脉注射细胞浓度为5×106mL-1的第3代hUC-MSCs细胞悬液0.2 mL；LiCl注射组：APP+小鼠每天腹腔注射0.03 g/kg的LiCl，连续注射1个月；联合处理组：APP+小鼠先尾静脉注射hUC-MSCs细胞悬液，再连续1个月每天腹腔注射LiCl；APP+组：尾静脉注射0.2 mL生理盐水。

1.4小鼠学习记忆能力的测定小鼠用Morris水迷宫水池直径120 cm，平台直径9 cm，分为4个象限，平台所在象限为第一象限，水池内水不透明，水温控制在19～20 ℃，水放至淹没平台1 cm，每个象限最长实验时间为60 s，实验结束后在平台上停留10 s，擦干，回笼。每只小鼠每天在不同象限固定位置入水，连续训练5 d，3次/d；第6天开始进行空间探索实验，即撤去平台，分别从4个象限将小鼠于训练时的固定位置放入水池中，观察并利用摄像采集器记录小鼠游泳轨迹，统计穿越平台次数、逃避潜伏期(即第一次到达平台所在位置所用时间)和平台所在象限停留时间。

1.5小鼠血清SOD活性、MDA含量的测定Morris水迷宫实验结束后，各组分别随机选取3只小鼠，活体心脏取血，3 000 r/min离心5 min，收集上清，-80 ℃保存。根据试剂盒说明书推荐方法，采用酶标仪法测定小鼠血清SOD活性，采用分光光度法检测血清MDA含量。

1.6小鼠海马组织中Wnt通路相关基因mRNA的检测Morris水迷宫实验结束后，各组分别选取3只小鼠，处死后取出脑组织，分离出海马，组织匀浆。根据说明书设定的程序采用qRT-PCR检测Wnt通路相关基因mRNA的表达。以小鼠GAPDH为内参。Trizol裂解法提取组织总RNA，分光光度计测RNA浓度，然后于-80 ℃条件下分装保存；取500 ng总RNA用反转录试剂盒合成cDNA，以此为模板，进行荧光定量PCR。引物序列及产物大小见表1。反应结束后观察扩增曲线和溶解曲线，采用比较CT法(ΔΔCT)进行数据分析。每组3个复孔，每个目的mRNA重复测定3次。

表1　引物序列及产物

1.8统计学处理采用SPSS 19.0处理数据，应用析因设计的方差分析对4组小鼠的水迷宫实验结果、海马组织中Wnt/β-catenin通路相关基因mRNA及蛋白表达水平、血清中SOD活性及MDA含量进行比较，检验水准α=0.05。

2结果

2.14组小鼠学习记忆能力的比较见表2。与APP+组相比，其他3组小鼠的逃避潜伏期缩短，穿越平台次数以及平台所在象限停留时间均增加，且联合处理组改变更为明显。

表2　4组小鼠学习记忆能力测试结果

2.24组小鼠血清SOD活性及MDA含量的比较

见表3。与APP+组相比，hUC-MSCs移植使小鼠血清中SOD活性增加，MDA含量下降，LiCl注射对血清中SOD活性无明显影响；但可使MDA含量降低，且与hUC-MSCs移植存在协同作用。

2.34组小鼠海马组织中Wnt/β-catenin通路相关基因mRNA的表达见表4。LiCl注射和hUC-MSCs移植可使APP+小鼠海马组织中β-catenin、c-Myc mRNA表达量升高， GSK-3β mRNA表达量下降，但两者之间无交互作用。

表3　4组小鼠血清SOD活性及MDA含量的比较

表4　4组小鼠海马组织中

2.44组小鼠海马组织中Wnt/β-catenin通路相关蛋白的表达见图1、表5。

APP+：APP+组；MSC：hUC-MSCs移植组；Li：LiCl注射组；Li+M：联合处理组。图1　4组小鼠海马组织中Wnt通路相关蛋白的表达

组别nGSK-3ββ-cateninc-MycAPP+组31.44±0.040.60±0.030.39±0.02hUC-MSCs移植组31.28±0.021.20±0.030.84±0.03LiCl注射组30.85±0.051.44±0.071.12±0.02联合处理组30.62±0.062.15±0.061.96±0.06F注射(P)166.917(<0.001)328.284(<0.001)590.151(<0.001)F移植(P)8.576(0.008)177.072(<0.001)286.769(<0.001)F交互(P)2.638(0.120)1.225(0.281)25.228(<0.001)

由图1、表5可以看出，LiCl注射和hUC-MSCs移植可增强小鼠海马组织中β-catenin、c-Myc蛋白的表达， 降低GSK-3β蛋白的表达，两者联合处理对c-Myc蛋白表达的影响具有协同作用。

3讨论

前期研究[8]发现LiCl对脊髓损伤大鼠具有修复作用，但是LiCl对AD的治疗作用国内尚无报道。该研究显示，LiCl腹腔注射能明显提高APP+转基因小鼠的认知能力，与文献[9-10]结论一致；而且与单独治疗组相比，hUC-MSCs移植联合LiCl的治疗效果更明显。

AD的一种病理机制为自由基引起的过氧化损伤。有研究[11]显示，干细胞移植可以有效降低阿尔茨海默病小鼠血清中过氧化终末产物MDA的含量，增加血清中SOD活性。此次实验进一步证实了该项结论。该研究结果显示，LiCl腹腔注射能有效降低APP+小鼠血清MDA含量，但无提高SOD活性的作用；LiCl联合hUC-MSCs对MDA含量的影响具有协同作用

目前，干细胞治疗AD的可能机制主要有细胞替代[12]、介导清除β淀粉样蛋白、分泌神经营养因子、抗炎及免疫调节等[13]。研究[14]发现hUC-MSCs移植可以促进β-catenin、c-Myc的表达，降低GSK-3β的表达，表明hUC-MSCs移植可能通过激活Wnt/β-catenin通路，从而提高APP+转基因小鼠的认知能力。LiCl也可以通过激活Wnt/β-catenin通路对AD起到治疗作用[6]。此次试验证实了上述结论，但两者联合应用虽然可以改善相关指标，但是并无明显的协同作用。可能的原因为：①实验的样本量有限，可能还不足以揭示两者之间的协同作用。②LiCl和hUC-MSCs对AD的联合治疗作用可能并不仅仅通过激活Wnt/β-catenin通路实现，或者由于其他因素的干扰导致两者对Wnt/β-catenin通路的协同作用表现不明显。

综上所述，hUC-MSCs移植可以激活Wnt/β-catenin通路，提高血清SOD活性，降低血清MDA含量，改善APP+小鼠的认知能力；LiCl腹腔注射亦可激活Wnt/β-catenin通路，降低血清中MDA含量，对AD起到治疗作用；两者联合治疗效果有协同增强的趋势，具体机制有待进一步探索。

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中图分类号R592

#通信作者，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：干细胞与神经修复，E-mail:guanfangxia@126.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.005

*国家自然科学基金资助项目81471306，U1404313；河南省高校科技创新团队项目15IRTSTHN022；河南省科技创新人才计划项目154

200510008