强骨宝对疲劳性损伤诱发膝骨关节炎模型大鼠的作用

李芃　张俐

【摘 要】目的：探讨强骨宝治疗大鼠膝骨关节炎模型的作用机制。方法：将56只8周龄SPF级雌性SD大鼠分为空白对照组8只，模型对照组24只，强骨宝组24只。强骨宝组及模型对照组大鼠通过行双侧卵巢切除术，并进行动物实验跑台训练以建立疲劳性膝骨关节炎模型。造模成功后，强骨宝组大鼠灌服强骨宝汤剂，模型对照组及空白对照组予以等量生理盐水，分别于给药1，2，3，4周后，取大鼠血清行诱导型一氧化氮合成酶（induced nitric oxide synthase，iNOS）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，

SOD）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）含量检测；取股骨下段行病理学观察；并检测大鼠膝关节软骨中iNOS蛋白表达。结果：①根据Mankin评分情况，给药第4周后，模型对照组大鼠关节软骨表现为中度损伤，强骨宝组大鼠关节软骨为轻度损伤。②给药第2周后，强骨宝组大鼠血清iNOS含量较模型对照组显著降低（F = 636.465，P < 0.05）；给药第3周后，强骨宝组SOD含量较前升高，且显著高于模型对照组（F = 1708.818，P < 0.05）；给药前3周，强骨宝组大鼠血清VEGF含量呈显著下降趋势（F = 252.740，P < 0.05），模型对照组呈增长趋势。③强骨宝组可见iNOS蛋白表达减弱，同一给药时间点，强骨宝组蛋白表达均低于模型对照组（F = 63.622，P < 0.05）。结论：强骨宝可抑制劳损性骨关节炎模型大鼠关节软骨病变的发展，从而减轻大鼠膝关节病变所产生的症状。

【关键词】 骨关节炎，膝；强骨宝；双侧卵巢切除；疲劳运动；模型；大鼠

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种以关节软骨的变性、破坏及骨质增生为特征的慢性关节病，较常见的发病部位包括膝、髋和脊柱关节等。本病属中医学“骨痹”“膝痹”范畴，其发病率较高，多见于中老年人，且女性多于男性，严重影响中老年人的生活质量。65岁以上人群中放射学OA的患病率可达50%以上，而在75岁以上人群中，可达到80%左右[1]。强骨宝是我国著名骨伤名老中医张安桢教授的经验方，临床应用60余年，具有益肾壮骨、活血止痛之功效，用于治疗骨与关节退行性变。本药现已通过薄层鉴别研究，制订了稳定的强骨宝胶囊质量标准[2-3]。本课题通过动物实验模拟女性膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA），观察强骨宝对KOA模型大鼠的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 动物分组与造模 8周龄SPF级雌性SD大鼠56只，体质量（200±20）g，上海斯莱克实验动物有限公司提供，动物许可证号：SCXK（沪）2012-0002；实验动物质量合格证编号：2007000549443；大鼠饲养在福建中医药大学实验动物中心，许可证号：SYXK（闽）2009-0001。饲养环境及饮食均符合动物饲养标准，实验过程中实验动物处置符合实验动物伦理学标准。按体质量均衡原则，采用随机数表法随机分为空白对照组

8只，模型对照组24只，强骨宝组24只，模型对照组及强骨宝组行双侧卵巢切除术及ZH-PT动物实验跑台运动训练，建立大鼠疲劳性KOA模型。具体训练方法如下：运动为持续性下坡跑，速度为16 m·min-1，坡度-16°，每次100 min，间隔

5 min，每日2次，连续训练35 d。运动中使用声、光刺激或毛刷刺激尾部，不使用电刺激。毛刷刺激大鼠尾部，仍跟不上预定速度，体征表现为呼吸急促，神情倦怠，后肢跛行，对刺激反应迟钝等，视为建立了疲劳性损伤模型[4-7]。

1.2 药物制备及给药 强骨宝由补骨脂、骨碎补、三七、甘草等药物组成，由福建省中医药科技开发总公司制备，加工成每毫升含生药1 g的药液，于

-20 ℃密封保存，用时分装后于4 ℃保存备用。造模35 d后，强骨宝组每天灌服强骨宝汤剂，大鼠给药剂量按与人的体表面积关系计算[8]，剂量为3.9 g·kg-1，

分早、晚2次进行，连续4周。模型对照组和空白对照组给等剂量生理盐水灌服，连续4周。

1.3 动物取材与指标检测 按实验设计，分别于给药1，2，3，4周后，模型对照组和强骨宝组各选取6只大鼠，抽取腹主动脉血，以酶联免疫吸附试验（ELISA，ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，测定步骤按试剂盒说明进行）方法检测血清诱导型一氧化氮合酶（induced nitric oxide synthase，iNOS）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）含量。分别取各组大鼠股骨下段，经充分固定脱钙后，石蜡包埋、切片，行HE染色，200倍光镜下以Mankin评分标准[9]评估关节软骨损伤程度，0～2分为正常软骨，3～5分为软骨表面纤维化，6～7分为中度软骨损伤，8～10分为重度软骨损伤，10分以上为软骨完全缺失。取各组大鼠膝关节面软骨，提取关节软骨蛋白，经蛋白深度定量后，行蛋白免疫印记杂交法（Western Blot）测定关节软骨中iNOS蛋白的表达情况。

1.4 统计学方法 采用SPSS 18.0软件进行统计分析。计量资料以表示，进行单因素方差分析（One-Way ANOVA）；采用二元定距变量Pearson简单相关系数进行相关分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠各给药时间点关节软骨的组织学形态及Mankin评分比较 给药1周后，模型对照组及强骨宝组关节软骨损伤形态差异无统计学意义（P > 0.05）。给药2周后，强骨宝组关节软骨损伤情况较同期模型对照组有所改善（P < 0.05）。给药4周后，模型对照组关节软骨损伤Mankin评分（6.333±0.516）分，为中度软骨损伤；强骨宝组关节软骨表面平整，基质染色均匀，细胞较前增多，评分（2.833±0.752）分，为轻度损伤，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图1、表1。

图1 各给药时间点关节软骨光镜切片（HE染色×200）

2.2 各组大鼠各给药时间点血清iNOS含量比较 给药1周后，模型对照组与强骨宝组iNOS含量比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。给药2周后，强骨宝组大鼠血清iNOS含量较模型对照组显著降低（P < 0.05），且呈持续降低。见表2。

2.3 各组大鼠各给药时间点血清SOD含量比较 给

药1，2周后，模型对照组与强骨宝组大鼠血清中SOD含量均呈下降趋势，强骨宝组SOD含量较模型对照组高（P < 0.05）。给药3周后，强骨宝组SOD含量较前升高，且显著高于模型对照组，但与空白对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。

2.4 各组大鼠各给药时间点血清VEGF含量比较 给药后前3周，强骨宝组大鼠血清VEGF含量呈显著下降趋势（P < 0.05），模型对照组呈增长趋势。给药4周后，强骨宝组VEGF含量改变，差异无统计学意义（P > 0.05）；与空白对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表4。

2.5 各组大鼠各给药时间点软骨细胞中iNOS蛋白表达比较 各组大鼠关节软骨中均有iNOS蛋白表达，但iNOS蛋白在正常软骨组织中表达较弱，经双侧卵巢切除以及动物实验跑台训练后，表达可见增强。经过强骨宝干预后，强骨宝组大鼠软骨组织iNOS蛋白表达减弱，并接近空白对照组蛋白表达（P > 0.05），见图2（1）、表5。同一给药时间内，强骨宝组蛋白表达均低于模型对照组

（P < 0.05），见图2（2）、表5。

注 1.空白对照组；2.给药1周后模型对照组；3.给药2周后模型对照组；4.给药3周后模型对照组；5.给药4周后模型对照组；6.给药1周后强骨宝组；7.给药2周后强骨宝组；8.给药3周后强骨宝组；9.给药4周后强骨宝组。给药1，2，3，4周后，与模型对照组比较，1）P < 0.05；给药4周后，与空白对照组比较，2）P > 0.05

图2 各组大鼠关节软骨中iNOS蛋白表达情况

3 讨 论

在现有的相关实验中，已知一氧化氮（NO）、VEGF、白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）等因子在关节软骨病变过程中起到重要作用[10-11]。OA发病早期，受损裸露的软骨细胞在周围细胞因子的作用下，诱发iNOS蛋白表达，从而导致NO大量释放。NO又进一步促进炎症细胞因子释放，从而抑制软骨细胞分泌细胞外基质和合成Ⅱ型胶原，影响软骨的营养交换，使软骨处在一个不良的微环境中，最终导致软骨质量不断下降和进行性退化[12]。OA的显著特征是关节软骨的血管化。血管通过纤维组织管道渗透到关节软骨，导致软骨细胞凋亡[13]。VEGF作为一个调节内皮细胞增殖和迁移的细胞因子，是导致OA中血管新生的最强有力的因素，其过度表达可能是导致OA滑膜血管翳形成，滑膜炎症持续存在并导致软骨破坏的关键因子[14]。而SOD作为自由基清除剂，其浓度下降导致细胞内自由基含量升高，抑制软骨细胞增殖致细胞死亡[15]，最终通过影响关节软骨的完整性，引起关节的退行性改变。

强骨宝具有益肾壮骨、活血止痛之功效。相关研究表明，骨碎补对大鼠实验性关节炎具有刺激骨关节软骨细胞代偿性增生作用，并能部分改善由于力学应力线改变造成关节软骨的退行性变，从而降低骨关节病变率[16-17]。郝小金等[18]通过实验观察补肾活血“对药”对兔KOA模型血清炎性细胞因子及氧自由基的影响，结果表明，补骨脂+骨碎补“对药”能降低IL-1、TNF-α及NO的含量，提高SOD水平。

在本实验中，经过药物干预，强骨宝组大鼠血清中iNOS、VEGF含量总体上（下转第43页）

（上接第33页）呈下降趋势，与同一给药时间周期内的模型对照组比较，其含量显著减少。iNOS蛋白在正常关节软骨蛋白中呈现较弱的表达趋势，但模型对照组大鼠在造模后，出现了iNOS蛋白表达的增强，且其表达程度显著高于同一给药时间周期内强骨宝组蛋白表达。在药物干预前2周，强骨宝组、模型对照组大鼠血清中SOD含量均呈下降趋势（强骨宝组含量较同一给药时间周期内模型对照组高）；给药3周后，强骨宝组大鼠血清SOD含量下降趋势减缓，并较前有所上升，而模型对照组SOD含量则持续下降。综上所述，可以认为，强骨宝可抑制关节炎模型大鼠血清中iNOS、VEGF的产生，以及减弱关节软骨中iNOS蛋白表达，同时减慢大鼠血清SOD下降程度，以达到减缓大鼠膝关节软骨病变发展的作用。

本次实验中所采用的造模方法及标本观察时间均在查阅大量文献的基础上制订，能成功制造出轻、中度膝关节软骨损伤形成KOA早期模型。在药物干预方面，根据相关实验结果，可认为强骨宝对大鼠早期KOA症状有治疗作用。但由于动物模型损伤程度所限，药物对KOA中、后期的病变是否能起到相同的治疗作用，还有待进一步观察。

4 参考文献

[1] 李儒军，林剑浩.骨关节炎流行病学的研究进展[J].中国临床医生，2010，38（7）：6-10.

[2] 姜学敏，陈伟玲，杨明容，等.强骨宝胶囊的薄层鉴别研究[J].福建中医学院学报，1997，7（4）：16-18.

[3] 姜学敏，陈伟玲，杨明容，等.双波长薄层扫描法测定强骨宝胶囊中补骨脂素和异补骨脂素的含量[J].福建中医学院学报，1998，8（1）：27-28.

[4] 张健，卜淑敏，魏兆松.运动结合药物对大鼠骨骼密度影响的研究[J].首都体育学院学报，2012，24（3）：274-279.

[5] 李世昌，季浏，马涛.不同方式跑台运动对去卵巢小鼠破骨细胞分化及相关调节因子的影响[J].中国体育科技，2011，47（5）：134-140.

[6] 周蔚，陈立军，张敏，等.不同训练负荷条件下SD大鼠运动模型的构建与评价[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14（37）：6899-6903.

[7] 唐海峰.大鼠的不同强度运动对早期关节软骨退变影响的实验研究[D].北京：中国医科大学，2010：6-21.

[8] 杨斐，胡樱.实验动物学基础与技术[M].上海：复旦大学出版社，2010：404-405.

[9] Makin HJ，Dorfrnan H.Biochemical andmetabolic abnormaliaties in caticular cartilage from osteoarthritisc human hips[J].Surg（Am），1971（53）：523-537.

[10] 石晓明，于占革.骨关节炎发病机制的研究进展[J].中华临床医师杂志：电子版，2013，7（24）：11607-11610.

[11] 赵雪梅，李鸿斌，肖镇.骨关节炎发病机制研究进

展[J].内蒙古医学杂志，2011，43（3）：321-327.

[12] 饶咏梅，杜建时，赵晴，等.白芍总苷对骨关节炎血清及关节液中一氧化氮及诱生型一氧化氮合酶的影响[J].中国实验诊断学，2006，10（12）：1444-1445.

[13] 唐静，李荣亨，周小莉.复元胶囊对实验性大鼠骨关节炎软骨中TNF-α和VEGF的影响[J].时珍国医国药，2010，21（6）：1374-1376.

[14] 朱宝玉，王奇缘，吴蓓，等.IL-6、VEGF在骨关节炎患者膝关节滑膜和滑液中的表达及其意义[J].中国老年学杂志，2012，32（2）：273-275.

[15] 陈瑞莲.超氧化物歧化酶在骨关节炎中的研究意义探讨[J].中医药临床杂志，2011，23（6）：475-477.

[16] 陈顺，关延彬.骨碎补药理作用的研究进展[J].医药导报，2006，25（7）：685-687.

[17] 朱慧锋，王唯佳，王珠美，等.骨碎补研究进展[J].中国骨伤，2009，22（1）：66-68.

[18] 郝小金，冯文进，郝华，等.补肾活血“对药”对兔膝骨关节炎NO、SOD、IL-1和TNF-α水平的影响[J].北京中医药，2010，29（5）：380-381.

收稿日期：2014-10-29；修回日期：2014-12-04