绵羊肺炎支原体固相竞争ELISA抗体检测方法的建立

2015-05-30 17:58宋蓉
农民致富之友 2015年20期
关键词:检测

宋蓉

[摘 要] 本文依据固相竞争原理建立绵羊支原体固相竞争快速检测方法,通过方阵法确定包被抗原、竞争抗体和酶标二抗的使用浓度,单因素实验考察了反应时间和封闭剂对固相竞争反应体系的影响,确立了最优反应条件。

[关键词] 绵羊肺炎支原体 竞争ELISA 检测

[中图分类号] S858 [文献标识码] A [文章编号] 1003-1650 (2015)10-0279-01

绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)是引起绵羊和山羊呼吸道疾病的最常见的病原之一。近年来,该病在世界上多个国家和地区普遍流行,对养羊业造成了巨大经济损失,严重威胁养羊业的健康发展。基于此,本研究在血清纯化的基础上建立了绵羊肺炎支原体固相竞争ELISA抗体检测方法,为相关疾病的有效的防控提供了保障。

1 材料

1.1 实验菌株 MOGH3-3绵羊肺炎支原体菌株由兰州兽医研究所提供

1.2 TSB-1培养基: 大豆胰蛋白肉汤(30g/L),乳糖(10g/L),酵母浸出液(100ml/L),10%马血清及青霉素(200U/ml)。

1.3 阴阳性血清样本 绵羊源支原体阳性样本63个,山羊源支原体阳性样本20个和46个支原体阴性血清样由兰州兽医研究所提供

1.4 试剂 新生牛、马、兔的血清购自兰州某生物公司; 辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG购自sigma公司; TMB购自sigma公司; 吐温-20 购自Solarbio 公司; 碳酸钠、碳酸氢钠、柠檬酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾等均为分析纯试剂。

1.5 仪器设备 iMARK 酶标仪、微量移液器、costar 96孔酶标板、落地式高速冷冻离心机、紫外可见分光光度计,恒温培养箱,电热恒温水槽。

2 方法

2.1 高免血清的制备

取冷冻保存MoGH3-3菌株连续传代培养复苏菌株,F6菌株接种TSB-1培养基,置37℃培养3d收获菌体。根据陈忠琼等建立的支原体膜蛋白提取方法制备免疫用膜蛋白抗原,将纯化的膜蛋白抗原加等量弗氏完全佐剂(Sigma公司产品)并完全乳化后,皮下多点注射免疫1.5千克~2.0千克健康公兔。首免后28天,用弗氏不完全佐剂(Sigma公司产品)等量乳化抗原,皮下多点注射兔子,加强免疫后7日耳静脉采少量血,1.0%琼脂扩散试验检测,效价达1:16以上时即可采血,分离血清,分装并于-20℃保存。

2.2 兔抗血清纯化

采集的高免兔抗血清使用HiTrap Protein A HP纯化柱纯化兔抗血清。上样前用10mL 0.1M的Tris-HCl 平衡纯化柱,兔抗血清和Tris-HCl缓冲液1:1混匀后上样,上样速度保持在0.5mL/min。上样结束后用10mL 0.1M的Tris-HCl洗涤纯化柱,洗去杂质蛋白。最后用5mL左右50mM甘氨酸溶液洗脫纯化柱,收集纯化蛋白,收集瓶预先加入0.1mL 的1.0M的Tris-HCl溶液,收集洗脱液缓慢摇匀,使其pH值恢复至中性。洗脱后用10mL 0.1M的Tris-HCl 平衡纯化柱,用5ml左右的20%乙醇充满纯化柱,以保存纯化柱。

2.3 竞争ELISA方法的建立

2.3.1 确定抗原、抗体和酶标二抗的使用浓度

2.3.1.1 抗原浓度确定

试验用方阵滴定法:用0.05mol/L 碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液(pH值为9.6)2倍系列稀释纯化后抗原(1:200~1:12800)横向包被酶标板,每孔100μl包被液, 4℃孵育过夜。PBST洗涤5次后,每孔加入兔抗血清100μl,37℃温育60min。竞争反应结束后每孔加入250μl PBST,洗涤5次,每孔加入50μl辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG,37℃温育60min,PBST洗涤5次后每孔加入TMB底物溶液50μl 37℃反应15min后,加入50μl 1.25M H2SO4终止反应,读取OD450nm的光吸收值,通过吸光值的反应曲线确定包被抗原饱和浓度。

2.3.1.2 竞争抗体浓度确定

通过确定的抗原使用浓度包被酶标板,倍比稀释纯化后竞争抗体(1:400~1:25600)加入酶标板,每孔加入兔抗血清100μl,37℃温育60min。竞争反应结束后每孔加入250μl PBST,洗涤5次,每孔加入50μl辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG,37℃温育60min,PBST洗涤5次后每孔加入TMB底物溶液50μl 37℃反应15min后,加入50μl 1.25M H2SO4终止反应,读取OD450nm的光吸收值,通过吸光值的反应曲线确定兔抗使用浓度。

2.3.1.3 酶标二抗浓度确定

参照2.3.1.2实验方法确定酶标二抗使用浓度。

2.3.2 二抗温育时间

抗原和竞争抗体按最适浓度稀释,二抗孵育时间选择37℃反应30min、45min、60min。测定阴阳性血清OD450nm值,比较各温育时间的P/N值,最后确定最佳的反应时间。

2.4 封闭条件

抗原包被过夜后,选择10%兔血清,10%牛血清和10%马血清封闭酶标板,37℃温育60min。按照2.3建立的方法检测阴阳性对照血清,最后读取OD450值,比较3种封闭剂的P/N值,确定最佳封闭条件。

3 结果

3.1 检测46份支原体阴性血清,83份阳性。检测阴性血清46份,其中2份可疑样本,特异性95.6%。阳性血清83份,敏感性100%。

表1 敏感性与特异性实验结果

3.2 检测方法测定24份支原体阴性血清,计算抑制率。平均抑制率为:X=0.127,标准差为S=0.042,临界值为PI=X+3S=0.25,则设定PI>0.25为阳性,PI<0.2为阴性,0.2≤PI≤0.25为可疑。

参考文献

[1]姚燕,马金萍,宋德荣. 贵州省绵羊支原体肺炎研究进展[J]. 现代农业科技,2015,05:294+296.

[2]张轩. 绵羊肺炎支原体多表位疫苗的研究及免疫试验[D].中国农业科学院,2013.

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