影响电化学免疫传感器性能因素的研究

邵玲轩　刘源　吴海云　席温新　戎凯云

摘 要：电化学免疫传感器具有选择性好、灵敏度高、检测速度快等特点，但由于诸多因素影响着它的正常使用和推广。通过实验研究发现，电极材料的选择、修饰方法和固定化技术使用等是影响其性能的主要因素之一。其次，采用的检测方法，信号的采集电路的设计，数据处理方法对其精度和稳定性也有很大的影响。此外，测试环境参数的设置如待测溶液的pH值、响应时间，激励信号的选择，电压范围的设置等因素都影响着电化学免疫传感器的性能。

关键词：免疫传感器；电化学；影响性能因素

引言

随着科技的发展，环境污染越来越严重，破坏了生态环境。为了实现快速检测水质中的污染物，以便达到快速治理，常采用电化学免疫传感器。免疫传感器具有多样性、响应时间短，使用寿命长，灵敏度高、可重复使用等特点，适用于便携式、在线检测和远程监控，已在军事科学，临床医学、食品检测及环境监测方面得到广阔的应用[1-3]。但是由于电化学免疫传感器的性能不稳定，使得该类传感器不能产业化和推广使用。文章以电流型电化学免疫传感器检测水中萘为例，对影响传感器的性能因素进行了初步探究。

1 电化学免疫传感器工作原理

電化学免疫传感器利用抗体和抗原之间的特异性的组合，改变其电化学信号，使敏感元件（抗原/抗体）固定在载体膜上，电极作为转换元件，传感器的反应信号通过转换器，再进行放大和处理并显示。

2 免疫电极的制备技术直接影响传感器的性能

免疫电极是电化学免疫传感器的核心部件，其制备通常包括电极制备和选择、电极的化学修饰和免疫识别分子的固定等过程。电极材料的选择、修饰方法和固定化技术的设计、操作步骤、优劣程度、稳定性、合理性与否对降低传感器的成本，提高传感器的选择性、稳定性和灵敏度有直接影响。

2.1 电极的制备

传感器的电极是敏感元件，它的性能如灵敏度、选择性受生物大分子包埋方式的影响。常见的方法有：吸附法，包埋法，电化学聚合方法，共价结合法、自组装法和交联的方法等。

研究采用三电极系统，工作电极选用铂电极。工作电极用0.1mm直径的铂丝做成半球状，将其粘接固定在一个塑料环中，然后将其叠合粘接在参比电极上，就构成了三电极微型电解池。在使用铂电极之前，要用酸碱反复清洗，并在0.025mol/L的氯化钾溶液中，于0.2-0.6V电压范围内，进行循环扫描，直至电流基线稳定为止。

2.2 电极的预处理

实验的信号源采用型号为CHI660D的电化学工作站。为了保证实验中工作电极上的电场分布均匀和电极的重复性良好，在电极使用之前用先用蒸馏水冲洗，在用紫外光杀毒处理，最后用氮气吹干，电极修复前后，电极上的电流电压图如图1所示。

生物识别元件的修饰是免疫传感器研制的关键步骤。修饰后的生物识别分子应保持良好的反应活性，且其活性或亲和位点能与目标物结合，并能尽量降低非特异性吸附，从而提高免疫传感器的信号响应、灵敏度和稳定性。

室温下，采用电位直测定抗原浓度的方法，把酶标记在免疫传感器的工作电极上，浸入等浓度梯度的H2O2溶液中，裸金电极作为参比电极，然后均匀的搅拌溶液，等待几秒之后，便可以测定电压值，直到记录下的电压值达到稳定。由于固定在免疫传感器上的酶与溶液中对应的酶标抗体分子进行特异性结合，清洗以后，加入HRP氧化双氧水，由此会产生电信号。而当底物浓度一定时，HRP浓度与电位的差值呈正比，相应的依附在免疫传感器表面的那部分HRP就会氧化双氧水，产生与之浓度呈正比的电位差。由于HRP这种标记酶的存在，使得溶液中的抗体浓度与电位差值呈现正比，所以可以根据实验测得的电位差值判断所测溶液的浓度，实验结果如图2所示。

实验发现，膜的薄厚、均匀度好坏、重复性、修复技术等直接影响着免疫传感器的性能。

3 信号采集与处理方式对特性的影响

3.1 采集信号的特点

在电化学传感器检测中，有时由于反应机理、溶液浓度等原因，反应产生的电流很小，可达到nA级甚至更小[4]，对微电流的采集，信号调理电路、噪声处理电路设计及抗外界干扰方法等对传感器的精度和稳定性影响较大。

3.2 电极系统的选择

根据待测物质所处系统环境的不同，精度要求不同，可选用两电极系统、三电极体系和四电极体系。如果确定辅助电极的电极电位在测试过程中不发生变化或者变化可忽略不计时，可选用两电极体系；当在外激励信号的作用下，为了克服电极极化和环境波动的影响，可利用一对外电极将激励电流导入液体，并测量一对内电极上的电压，采用四电极系统。它主要采用的是交流阻抗法，测试电阻；在三电极体系中，由于电流不通过参比电极，使得辅助电极和工作电极之间的电压比两电极体系中工作电极和参比电极之间的电压更稳定，所以三电极体系是最通常的选择。

3.3 采集系统影响性能因素

3.3.1 恒电位电路对传感器特性的影响

在三电极系统中，恒电位电路的设计精度是保障系统检测精度的主要因素之一。在氧化还原反应的过程中，由于工作电极反应物质浓度的下降，系统稳定性发生了改变，会影响系统测量。采用恒电势电路，使用三个电极电位闭环负反馈调节系统保持在一个稳定的状态，消除由于反应时间和电极电位的影响，它解决了因反应造成外部激励信号值偏离以及溶液电阻Ru的存在是造成控制误差，保障检测结果的准确性。恒电位仪是各种三电极式（工作电极、辅助电极、参比电极）电化学传感器的接口，主要将外部激励信号近乎准确地施加于传感器上，驱动样品溶液发生电化学反应，并对产生的响应信号做相应的预处理（信号转换、放大、滤波）[5-6]。目前多选用全差分型的恒电位仪芯片。

3.3.2 信号处理电路设计对传感器特性的影响

信号处理多采用高阶低通滤波器电路、噪声处理电路和放大电路，I/V转换的作用是将电流信号转换为电压信号的装置；低通滤波器电路是将高频干扰信号去除，而电压信号的干扰输出稳定，AD转换器最好选用精度高，抗干扰能力强的芯片。

4 测试环境参数的设置对传感器性能的影响

4.1 pH值对输出电流的影响

溶液的pH值对免疫传感器电位响应有显著的影响。在其他保持不变的情况下，实验研究了pH 5.5-8.5的PBS溶液对免疫传感器电流响应是有影响的，如表1所示。

当pH在5.5～7.4范围，氧化峰电流飞速减小至最小值；在pH在7.4-8.5内，pH逐渐增大，伴随着峰电流的逐步增大。当pH=7.4时，抗原抗体结合产生的复合物紧紧地附着在免疫传感器的电极层面上，这样才导致电流值降到最小值。

4.2 测试时间对电流/电压的影响

图3所示的是在相同浓度下，分别在不同氧化还原反应时间（马上测、4分钟、10分钟、16分钟、19分钟和22分钟），对应的电压值和电流值的变化。从图中可以看出，任何一个待测浓度溶液，在外加激励信号后，应放在13-16分钟，待进行充分的氧化还原反应后，再测试，才能保证测试的准确性。

4.3 扫描速度对传感器性能的影响

在配置的溶液中选取浓度为0.5×10-3mol/L的溶液五组，改变仪器的扫描速度，以0.05V/s为步长，0.05V/s为初始扫描速度，实验数据如表2所示。

显然从表2可以直观的看出，随着仪器扫描速度的增加，正负峰的峰值电流的差值逐渐增大，那是因为扫描速度小，那么实验过程中受溶液中的离子的扩散传递的影响就越小，从而使电流正负峰的偏移就越小，这也就更加能反映这个化学反应的实质，即实验所得的结果更加准确，但是扫描速度并不是越小越好，因为这不但会影响实验所需的时间，更重要的是会造成电极的自我腐蚀，破坏电极，造成电极的极化现象，这会严重影响实验的准确性，因此建议在实验过程中将扫描速度控制在0.08V/s-0.12V/s之间，这就能保证仪器的正常使用且得到的实验数据准确性较高，也就能使该传感器处于一个较好的灵敏度。

此外，选择不同种类的激励信号，对传感器的测试结果也有较大的影响。再者，还有激励信号的电压范围的设置，需要通过试验进行选择，否则会影响测试结果。还有水环境中存在复杂多变的基质，会严重干扰免疫分析的准确性和稳定性。

参考文献

[1]Wang G L， Xu J J， Chen H Y， et al. Label-free photoelec-trochemical immunoassay for α-fetoprotein detection basedon TiO2/CdS hybrid[J]. Biosensors and Bioelectronics，2009，25：791-796.

[2]Zhao L F， Li S G， He J， et al. Enzyme-free electrochemicalimmunosensor configured with Au-Pd nanocrystals and N-doped graphene sheets for sensitive detection of AFP[J].Biosensors and Bioelectronics，2013，49：222-225.

[3]肖飞.新型电化学免疫传感器的制备及其在食品安全检测中的应用研究[D].华东师范大学，2012.

[4]杜黎.电化学传感器测试电路设计与实现[D].大连理工大学，2009，12.

[5]钟海军，邓少平.恒电位仪研究现状及基于恒电位仪的电化学检测系统的应用[J].分析仪器，2009，2：1-5.

[6]姚毓升，解永平，文濤.三电极电化学传感器的恒电位仪设计[J].仪表技术与传感器，2009（9）：3-6.

作者简介：邵玲轩（1994-），女，学生，从事生物传感器及智能仪器方向的研究。

*通讯作者：刘源（1964-），女，教授，从事生物传感器及智能仪器方向的研究。