中药虎杖体外抗新城疫病毒活性试验

赵增成 傅剑 李颖 林树乾 李桂明 黄中利 冯敏燕 宋敏训

摘  要：为了筛选出有效的防治新城疫的中草药，采用鸡胚接种试验，对虎杖煎煮液的体外抗新城疫病毒活性进行了测定，结果表明：中药虎杖在体外对新城疫病毒具有较好的抑制作用。

关键词：虎杖;新城疫病毒;鸡胚试验

中图分类号：S858.313.76     文献标识码：B     文章编号：1673-1085（2015）04-0013-04

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的一種禽类的高度接触性、传染性、致死性疾病，是严重影响养鸡业健康发展的重要疫病之一。尽管世界各国对ND都采取了严密的防控措施，但它依旧是危害禽类的主要传染病[1，2]。中药虎杖（Rhizoma Polygoni Cuspidati）为蓼科植物虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.Et Zucc）的干燥根茎和根，虎杖性微寒、味微苦，归肝、胆、肺经，具有利湿退黄、清热解毒、散瘀止痛、止咳化痰之功效。现代研究表明，虎杖含有多种生物活性成分，具有抗菌、抗病毒等作用[3，4]。为了寻求有效的防治新城疫的药物，我们采用鸡胚接种试验对虎杖的抗NDV效果进行了测定。结果表明，虎杖煎煮液在体外具有极好的抗NDV作用。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  虎杖  中药饮片，购自济南宏济堂药店，经检验合格。

1.1.2  病毒  NDV F48E8株，由本所禽病研究室提供。

1.1.3  鸡胚  10日龄SPF鸡胚，由山东昊泰实验动物繁育有限公司提供。

1.1.4  1%鸡红细胞悬液  采取成年健康SPF公鸡血液，以3.8%枸椽酸钠溶液（1：4）抗凝，加5倍生理盐水洗涤，2000r/min离心5min，洗涤三次，取沉淀红细胞用生理盐水稀释而成。

1.2  方法

1.2.1  虎杖提取液的制备  称取200g生药置三角瓶中，加水适量浸泡1h，置电炉上煮沸后煎煮30min，倒出药液。再同法煎煮一次。合并药液，浓缩药液至200ml，使每毫升药液相当于含生药lg。高压灭菌后，置4℃冰箱保存备用。用前取煎煮液置微量离心管中10000r/min离心8min，取上清液。用生理盐水分别稀释成1、0.8、0.6、0.4、0.2g/ml 5种不同的浓度。同时取虎杖原液10ml用饱和氢氧化钠溶液调节pH至7.0。

1.2.2  NDV的传代及效价测定  将NDV用0.9%灭菌生理盐水作1000倍稀释后经尿囊腔接种10枚SPF鸡胚（0.1ml/胚）。接种后的鸡胚置37℃恒温箱培养96h，收获24～96h死亡胚的尿囊液，测定HA效价。选取HA效价达1：256以上者用作试验病毒。

1.2.3  鸡胚半数感染量（EID50）测定  按Reed- Muench法进行[5]，试验采用200EID50的病毒。

1.2.4  虎杖提取液对鸡胚的安全浓度测定  取以上5个稀释度的中药液分别接种5枚10日龄SPF鸡胚，0.1ml/胚，37℃继续孵育鸡胚，观察鸡胚生长发育情况。若5枚鸡胚全部存活96h以上，则判定该药物浓度对鸡胚是安全的，以此确定出药液的最大安全浓度。

1.2.5  鸡胚接种  采用尿囊腔接种法[6]，按以下两种方式进行。同时用生理盐水替代中药，作为病毒对照组。

方式一，先将中药与病毒在胚外混合作用，再接种鸡胚：先将NDV稀释成200EID50的病毒液，分别取1ml病毒液与各种最大安全浓度的中药液1ml在微量离心管中混合，室温下作用20min，再取混合液0.2ml尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每种药物接种15枚鸡胚。

方式二，先接种中药，再接种病毒：先将中药液0.1ml通过尿囊腔接种鸡胚，封口，37℃孵化1h后，再接种200EID50的病毒液0.1ml，每个稀释度的中药液分别接种15枚鸡胚。

鸡胚接种完后，置37℃恒温箱孵育96h，每日照蛋，弃去24h内的死胚，24h以后死胚及96h后存活鸡胚均置4℃冰箱保存，测定尿囊液血凝效价，并观察胚体病理变化。记录鸡胚死亡时间、死亡数及尿囊液血凝滴度。

1.2.6  血凝试验  采用微量凝集法[7]，在96孔V型凝集板上用微量移液器每孔加入50μL生理盐水，再吸取尿囊液50μl于第1孔中，充分混合后再从第1孔吸50μl至第2孔，依次作倍比稀释，至第10孔，最后2孔分别作抗原及红细胞对照，再吸取1%红细胞悬液依次加入各孔，每孔50μl，至37℃温箱作用20min，判定血凝滴度。

1.2.7  判定标准  观察胚胎变化，根据各组鸡胚死亡数量、死亡时间、血凝效价，与对照组进行对比分析。

2  结果与分析

2.1  NDV对鸡胚半数感染量的测定  通过测定，EID50=10-8.36/0.1ml。

2.2  虎杖提取液安全浓度测定结果  在0.2g/ml、0.4g/ml、0.6g/ml、0.8g/ml、1g/ml 5种不同的浓度下，鸡胚均无出现死亡，表明虎杖提取液对鸡胚安全性较高，药液最大安全浓度可达1.0g/ml。

2.3  虎杖提取液对鸡胚病毒抑制试验结果

2.3.1  第一种加药方式（即先将中药与病毒在胚外混合再接种鸡胚）结果  病毒对照组鸡胚48h全部死亡，死亡鸡胚全身充血、出血，头、腹、背和趾部更加明显。药液浓度在0.4～1.0g/ml时，试验组鸡胚96h后均全部存活;药液浓度为0.2g/ml时，96h后鸡胚存活率为93.3%。数理统计表明，鸡胚存活率各用药组与病毒对照组相比差异极显著（P<0.01）。从HA滴度来看，各药物试验组HA滴度均为0，病毒对照组为9.6，差异极显著（P<0.01）。虎杖提取液pH调节至中性后，与调节前相比，其鸡胚存活率及HA滴度均无明显差异。鸡胚死亡及平均血凝滴度结果详见表1。

2.3.2  第二种加药方式（即先接种中药，再接种病毒）结果  病毒对照组鸡胚48h全部死亡，而各试验组48h时鸡胚存活率为40%和60%。统计结果表明，48h鸡胚存活率各用药组与病毒对照组相比差异显著（P<0.05）。从HA滴度来看，各药物组HA滴度均低于病毒对照组，差异显著（P<0.05）。鸡胚死亡及平均血凝滴度结果详见表2。

3  讨论

3.1  在两种接种方式中，不同浓度的虎杖提取液均表现出了明显的抑制NDV的效果，这表明虎杖具有较好的体外抗NDV作用，并且随着浓度的升高其抗病毒作用进一步增强。

3.2  虎杖煎煮液pH为4.0左右，呈弱酸性。在体外抗病毒试验中，各试验组虽然表现出了较好的抗病毒结果，但也有可能与药液呈酸性抑制了病毒活性有关。为此，我们将虎杖原液pH调节到了中性。调节至中性后的虎杖液仍然表现出了很好的抗NDV效果，与虎杖原液相比并无显著差异。这说明虎杖提取液的抗NDV作用与pH无关，而是虎杖自身药效的结果。

3.3  虎杖中主含二苯乙烯类、蒽醌类、黄酮类、鞣质及多糖类化学成分。二苯乙烯类主要有白藜芦醇（resveratro1）、虎杖苷（polydatin）及其衍生物;蒽醌类成分主要有大黄素（emodin）、大黄素甲醚、蒽苷A、蒽苷B、大黄酸、大黄酚等;黄酮类成分主要有虎杖素（reynoutrin）、槲皮素（quercetin）等[8-10]。虎杖具有确切的抗病毒作用，但其抗病毒活性物质基础尚不太清楚，哪些成分对NDV具有抑制作用，还需要进一步试验研究。

参考文献：

[1]  任涛.新城疫难以控制的原因及综合防控措施[J].中国家禽，2013，35（23）：37～38.

[2]  吴延功，丁国义，宋翠平，等.新城疫的流行特点与防控措施[J].中国家禽，2012，34（5）：5～7.

[3]  樊慧婷，丁世兰，林洪生.中药虎杖的研究进展[J].中国中药杂志，2013，38（15）：2545～2547.

[4]  陈考坛，周伟玲，刘嘉炜，等.虎杖抗H1N1流感病毒神经氨酸酶活性成分研究[J].中国中药杂志，2012，37（20）：3068～3070.

[5]  殷震，劉景华.动物病毒学[M].第二版.北京：科学技术出版社，1997.329～330.

[6]  胡桂学.兽医微生物学实验教程[M]. 北京：中国农业大学出版社，2006 .117～119.

[7]  纪铁鹏，王德芝.微生物与免疫基础[M].北京：高等教育出版社，2007.376～377.

[8]  郑继方.兽医中药学[M].北京：金盾出版社，2012.508～510.

[9]  孔晓华，周玲芝.中药虎杖的研究进展[J].中医药导报，2009，15（5）：107～109.

[10]  贾玉梅，王君明，崔瑛. 基于二苯乙烯类为主要活性成分的虎杖药理作用研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（9）：263～266.