补肾膏等院内膏方微生物限度检查方法的建立

郭红玲

【摘 要】 目的：建立我院膏方微生物限度检查方法。方法：根据2010版《中国药典》规定，对我院补肺膏等10个基础膏方进行微生物限度检查方法的验证。结果：补肺膏、养颜调经膏、糖尿病膏、温阳培补膏等4种膏方具有一定的抑菌作用，其余6种膏方无抑菌作用。结论：补肺膏、养颜调经膏、糖尿病膏、温阳培补膏4种膏方采用培养基稀释法检查其微生物限度；补肾膏、三仙滋补膏、益智安神膏、滋阴润燥膏、儿童健脾开胃膏、培元固卫膏6种基础膏方用常规平皿法检查微生物限度。

【关键词】 膏方；微生物限度；方法建立

【中图分类号】R446.5 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）11-0007-03

膏方又称“膏滋”或“煎膏”，是最古老的剂型之一[1] ，多具有滋补，预防与治疗作用，特别是对于亚健康与体弱多病者的调养效果显著。随着生活水平的不断提高，人们对健康意识不断增强，中医药养生知识的大量普及[2] ，使膏方在各地区也越来越得到大众的认可。

目前，各医院制作的膏方无统一质量控制标准，且文献对膏方质量控制的报道不多，特别是微生物方面的文献更少[3] 。然而，医院膏方的制作多采用手工传统制作方法，容易受操作器具、原辅料及环境微生物污染，有必要对医院制作的基础膏方建立相应的微生物限度检验方法，以确保卫生学的安全性。根据2010版《中国药典》附录的规定，在药品进行检验前必须进行方法学验证。故本实验室根据2010版《中国药典》一部附录要求，查阅相关文献[4-7] ，对我院补肺膏、养颜调经膏、糖尿病膏等10种基础膏方进行微生物限度检测方法摸索，建立了我院基础膏方微生物限度检验方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器 立式压力蒸汽灭菌器（湖南衡阳金一帆制药设备实业有限公司）；XPX-150型生化培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）；MJ-160-Ⅱ型霉菌培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）；电热恒温培养箱（武汉武昌实验仪器厂）；紫外仪（上海安亭电子仪器厂）。

1.2 材料

1.2.1 菌种 金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003] 、大肠埃希菌[CMCC（B）22102] 、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501] 、白色念珠菌[CMCC（F）98001] 、黑曲霉菌[CMCC（F）9003] ，均由中国药品生物制品检定所提供。

1.2.2 培养基 胆盐乳糖增菌液（批号：120627）、玫瑰红钠琼脂（批号：120522）、营养琼脂（批号120423）、营养肉汤（批号：121205）为北京三药科技开发公司产品；改良马丁（批号：120215）、改良马丁琼脂（批号：121025）为杭州微生物试剂公司产品。

2 方法

2.1 菌液的制备 按照2010版《中国药典》一部附录ⅫⅠ[7 ] 要求制备。

2.2 供试液的制备 取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪混匀，制成1∶10的供试液。

2.3 细菌、霉菌及酵母菌计数验证方法（平皿法）

2.3.1 试验组 取“2.1”项下菌液1ml和“2.2”项下1：10供试液1ml，注入同一直径为90mm的平皿中，立即倾注45°营养琼脂培养基15～20ml，平行制备2个平皿。

2.3.2 菌液组 分别取“2.1”中的每一种试验菌加入培养皿中，注入45°营养琼脂培养基测定菌液菌落数。将以上制备的培养皿，细菌置于30～35℃培养48小时；霉菌置于25℃培养72h，每日观察测定菌液菌落数。

2.3.3 供试品对照组 取“2.2”项下1∶10供试液1ml，注入培养皿中，立即倾注45°营养琼脂培养基15～20ml，测定供试品本底菌落数。

2.3.4 稀释剂对照组 取“2.1”项下菌液1ml和“2.2”项下稀释剂1ml，注入培养皿中，立即倾注45°营养琼脂培养基15～20ml，测定其菌落数。

2.4 培养基稀释法

2.4.1 试验组 取“2.2”项下1∶10的供试液的供试液2ml，每1ml供试液分别等量注入5个平皿中，每10个皿为一组。取“2.1”项下金黄色葡萄球菌菌液1ml，分别注入上述培养皿中，立即倾注45°营养琼脂培养基15～20ml，置于30～35℃培养48h，测定其菌落数。

2.4.2 菌液组 取“2.1”项下金黄色葡萄球菌试验菌液1ml加入培养皿中，注入45°营养琼脂培养基测定菌液菌落数。将以上制备的培养皿，细菌置于30～35℃培养48h，每日观察测定菌液菌落数。

2.4.3 供试品对照组 取“2.2”项下1∶10供试液0.2ml，注入培养皿中，立即倾注45°营养琼脂培养基15～20ml，测定供试品本底菌落数。

2.3.4 稀释剂对照组 取“2.1”项下菌液1ml和“2.2”项下稀释剂0.2ml，注入培养皿中，立即倾注45°营养琼脂培养基15～20ml，测定其菌落数。

2.5 控制菌检查方法验证

2.5.1 供试液制备 同“2.2”项下供试液制备。

2.5.1.1 试验组 取1∶10供试液10ml与“2.1”项下制备的大肠杆菌阳性菌液1ml注入100ml胆盐乳糖培养基中，置于35℃，培养18～24h后，取该培养物0.2ml，接种至5mlMUG培养基中，培养，分别于5h、24h置366nm紫外光下观察有荧光反应，沿试管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色。

2.5.1.2 阴性对照组 取1∶10供试液10ml与“2.1”项下制备的金黄色葡萄球菌阳性菌液1ml注入100 ml胆盐乳糖培养基中，置于35℃，培养18～24h后，取该培养物0.2ml，接种至5mlMUG培养基中，培养，分别于5、24h置366nm紫外光下观察无荧光反应，沿试管壁加入数滴靛基质试液，液面呈本色，结果为阴性。

2.5.2 大肠菌群检查方法验证

2.5.2.1 供试液制备 取1∶10的温阳培补膏供试液采用逐级稀释法，稀释为1∶100，1∶1000的供试液。

2.5.2.2 试验组 分别取“2.5.2.1”项下1∶10，1∶100，1∶1000的供试液各1ml，分别加入10ml的乳糖胆盐发酵培养基中，并分别加入“2.1”项下制备的大肠杆菌阳性菌液1ml，培养18～24h，观察结果。

2.5.2.3 阴性对照试验 取稀释液1ml加入10ml乳糖胆盐发酵培养基中，培养18～24小时，观察结果，结果为阴性。

2.5.2.4 供试品检查 分别取“2.5.2.1”项下1∶10，1∶100，1∶1000的供试液各1ml，分别加入10ml的乳糖胆盐发酵培养基中，按2010版《中国药典》一部附录要求操作，观察结果。

3 结果

3.1 菌数回收率的计算

[HT6”SS][JP3]稀释剂对照组的菌数回收率（%）=稀释剂对照组的平均菌落数菌液组的平均菌落数×100%[JP]

[JP4]试验组菌数回收率（%）=实验组平均菌落数-共试品对照组平均菌落数菌液组的平均菌落数×100%[JP][HT]

《中国药典》2010版规定各试验菌株的回收率（%）均得大于70%。

3.2 常规平皿法验证结果 用常规平皿法对10种膏方的细菌、霉菌与酵母菌计数的验证，结果见表1。由表1可知，补肺膏、养颜调经膏、糖尿病膏、温阳培补膏四种基础膏方用常规平皿法测定其枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的回收率在70%以下，说明该四种基础膏方对草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌作用较强；改用培养基稀释法测定，其结果见表2，但白色念珠菌、大肠埃希菌及黑曲霉菌回收率均在70%以上，说明其对这3种菌无抑菌作用，可以用常规平皿法测定这三种膏方的霉菌与酵母菌。补肾膏、三仙滋补膏、益智安神膏、滋阴润燥膏、儿童健脾开胃膏、培元固卫膏6种基础膏方用常规平皿法测定其细菌与霉菌及酵母菌计数验证回收率均在70%以上，说明可以用常规平皿法对补肾膏、三仙滋补膏、益智安神膏、滋阴润燥膏、培元固卫膏、儿童健脾开胃膏进行细菌与霉菌及酵母菌的微生物限度测定。

3.3 培养基稀释法验证结果 用培养基稀释法对补肺膏等4种基础膏方的霉菌及酵母菌计数测定法进行验证。有表2可知，枯草胞杆菌及金黄色葡萄球菌回收率均在70%以上，说明培养基稀释法可以用于补肺膏、养颜调经膏和糖尿病膏的微生物限度测定。

3.4 控制菌检查方法验证结果 采用2010版《中国药典》一部附录方法对10种膏方的控制菌检查方法进行验证，结果均符合要求，结果表明可以采用常规法，对我院各膏方进行控制菌微生物限度检查。

4 讨论

中药膏方是自古以来就有的传统中药剂型之一，不仅是单纯的补药，兼有治疗和预防，即“祛病纠偏”的双重疗效，集补、调、疗的综合功效[8、9] ，在养生、慢性疾病及治未病方面起到良好的疗效。随着现代人生活节奏的加快，亚健康人群的不断壮大及养生观念的不断加强，冬令膏方在我国越来越受到重视，但关于其质量控制的文献报道较少，特别是微生物限度测定的更少。因膏方含药味多，处方量大，在制作过程中可能会受到微生物污染，为了保证其安全，根据2010版《中国药典》的要求，对我院自制的10种基础膏方进行微生物限度测定的方法学验证，建立了我院基础膏方微生物限度测定的方法。

通过验证试验发现，含有清热解毒类、化痰止咳类中药材的膏方，因部分药材本身具有较强的抑菌作用，其加工制备后仍具有一定的抑菌作用。常规平皿法不能直接用于该类膏方的微生物限度测定，而选用培养基稀释法测定。通过验证，我院基础膏方的霉菌与酵母菌检查法基本都可以采用常规法测定。补肺膏、养颜调经膏、温阳培补膏、糖尿病膏等膏方的细菌检查法需采用培养基稀释法测定。控制菌检查都可以采用2010版《中国药典》规定的常规法进行。

通过对膏方微生物限度的测定方法的验证，制定合适的膏方微生物限度测定方法，确保膏方在制作的过程中不被微生物污染，避免膏方在患者服药的长期贮存中霉变而变质，保证患者用药的安全性，为膏方质量控制的制定提供一定的基础。

参考文献

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[2] 史红霞，屠亚军.膏方在现代临床中的应用[J].中国社区医师.医学专业，2012，13（14）：33.

[3] 陈国宝.膏滋药质量控制探析[J].中医药临床杂志，2012.7（7）：681-684.

[4] 黄文娴，金国良.5种医院制剂微生物限度及其质量考察[J].抗感染药学，2011，9（3））：198-200.

[5] 柳冬梅.当归养血膏微生物限度检查法验证[J].现代医药卫生，2009，25（22）：3379-3381.

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[9] 杨志敏，谢东平.颜德馨膏方治疗高脂血症经验[J].上海中医药杂志，2005，39（12）：8-9.