止咳枇杷颗粒微生物限度检查方法验证

郭秀秀

【摘 要】 目的：止咳枇杷颗粒的微生物限度检查的方法验证。方法：按《中国药典》2010年版附录微生物限度检查法规定的方法进行验证试验。结果：大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌以常规法验证回收率均大于70%。结论：止咳枇杷颗粒的细菌、霉菌和酵母菌的计数方法可采用常规法，控制菌可采用常规法检验。

【关键词】 止咳枇杷颗粒；微生物限度检验法；方法验证

【中图分类号】R921.2 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）13-0008-02

止咳枇杷颗粒是一种常用中成药，具有清肺、止咳、化痰的作用，用于咳嗽多痰。处方由枇杷叶、白前、桔梗、桑白皮、百部、薄荷脑六味中药组成，其中桔梗、百部、薄荷脑均具有一定的抑菌作用[1]。《中国药典》2010版附录Ⅻ-ⅠC微生物限度检验方法中规定，建立药品的微生物限度检验方法必须进行方法验证，确证供试液制备、测定方法及检测系统适用于该药品的检验，保证微生物限度检验方法的科学性和检验结果的准确性。本文参照2010年版《中国药典》[2]、《中国药品检验标准操作规范》[3]进行试验，对止咳枇杷颗粒的微生物限度检验方法进行方法验证，结果表明细菌、霉菌及酵母菌计数可采用常规法、控制菌检查可采用常规法。

1 试验环境与材料

1.1 试验环境 根据2010年版《中国药典》规定，试验在环境洁净度10000级、局部洁净度100级的单向流空气的无菌室进行，阳性菌操作在符合国家Ⅱ级生物安全标准的生物安全柜内进行。

1.2 实验仪器 BHC-1300ⅡA2型生物安全柜（苏州苏净仪器自控设备有限公司）；GHP-9162型电热恒温培养箱（上海金慧科电子有限公司）；MJX-160B-Z型微电脑霉菌培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；DYX-DHS型隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）；YXQ-LS-75SⅡ型立式压力蒸汽灭菌器（上海市博讯实业有限公司医疗设备厂）；TZQ-Ⅱ型匀质器型号（天津市津德实验仪器技术开发中心）。

1.3 供试品 止咳枇杷颗粒（批号：20140429、20140501、20140502，安徽省雪枫药业有限公司）。

1.4 验证菌种 大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B） 44 102]、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B） 63 501]、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B） 26 003]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F） 98 001]均由中国医学菌种保藏中心提供，黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F） 98 003]由中国药品生物制品检定所提供，试验用菌株的传代次数为3代。

1.5 培养基 营养琼脂培养基（批号：121130）、玫瑰红钠琼培养基（批号：110811）、营养肉汤培养基（批号：110406）、改良马丁培养基（批号：130227）、曙红亚甲蓝琼脂培养氧基（EMB，批号：1110102）、胆盐乳糖培养基（批号：1111162）、4-甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG，批号：1110102）均由北京三药科技开发公司提供。

根据2010年版《中国药典》附录Ⅻ-ⅠC的规定，计数培养基符合计数培养基适用性检查的要求；控制菌检查用培养基符合促生长、指示和抑制能力的要求。

1.6 稀释剂 0.9%无菌氯化钠溶液（蚌埠丰原涂山试剂有限公司）；pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（杭州微生物试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 [JP3]菌悬液的制备 枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌在营养肉汤培养基中33℃培养24h，各取1ml培养物用0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释至10-5、10-7、10-7，备用；白色念珠菌在改良马丁液体培养基中经25℃培养24h，取培养物1ml用0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释至10-5，备用；黑曲霉在改良马丁斜面培养基中经25℃培养1周，用5ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液洗下黑曲霉孢子，吸取经无菌棉花过滤的孢子菌悬液1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释至10-6，备用。[JP]

2.2 菌悬液中含菌量检验 取“2.1”中枯草芽孢杆菌10-5级稀释液1ml放入已灭菌的平皿中，用45℃无菌营养琼脂培养基20ml注皿且平行测定两皿，33℃培养48h计数；取10-7级金黄色葡萄球菌、10-7级大肠埃希菌分别注皿培养，方法及培养条件同枯草芽孢杆菌。取“2.1”中白色念珠菌10-5级稀释液1ml放入已灭菌的平皿中，用45℃玫瑰红钠琼脂培养基20ml注皿，平行测定两皿，25℃培养5d逐日观察计数；取10-6级黑曲霉孢子菌悬液1ml注皿培养，方法及培养条件同白色念珠菌。

根据2010年版《中国药典》规定，细菌、霉菌和酵母菌方法验证所用菌悬液含菌量应为50～100 cfu/ml；控制菌方法验证所用菌悬液含菌量为10～100 cfu/ml。结果见表1，符合要求。

2.3 供试液制备 取本品最小包装两袋（10g/袋），按微生物限度检查法规定称取10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，匀浆仪2000转/min，3min混匀，即为1∶10的供试品溶液。

2.4 细菌、霉菌和酵母菌计数方法验证

2.4.1 常规法 按照2010年版《中国药典》规定需进行3次独立的平行试验，且每次每种菌种需平行2皿。

2.4.2 试验组 取1∶10供试液1ml，枯草芽孢杆菌10-5级菌悬液1ml，注入无菌平皿，立即倾注45℃无菌营养琼脂培养基20ml，待凝固后置33℃阳性细菌培养箱中倒置培养24～72h，逐日观察结果并记录。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌同枯草芽孢杆菌。取1∶10供试液1ml，白色念珠菌10-5级菌悬液1ml，注入无菌平皿，立即倾注45℃无菌玫瑰红钠培养基20ml，待凝固后置25℃阳性霉菌培养箱中倒置培养5d，逐日观察结果并记录。黑曲霉同白色念珠菌。

2.4.3 菌液组 取枯草芽孢杆菌10-5级、金黄色葡萄球菌10-7级、大肠埃希菌10-7级菌悬液各1ml，分别注入平皿，立即倾注营养琼脂培养基，待凝固后置33℃细菌阳性培养箱中培养24～72h，逐日观察结果并记录。取白色念珠菌10-5级和黑曲霉10-6级菌悬液各1ml，分别注入平皿，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后置25℃霉菌阳性培养箱中培养5d，逐日观察结果并记录。

2.4.4 供试品对照组 取1∶10供试液1ml，注入平皿，立即倾注45℃无菌营养琼脂培养基或45℃无菌玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后营养琼脂培养基置阴性细菌培养箱中33℃培养24～72h，玫瑰红钠琼脂培养基置阴性霉菌培养箱中25℃培养5d，逐日观察结果并记录。

2.4.5 稀释剂对照组 取0.9%无菌氯化钠溶液1ml，枯草芽孢杆菌10-5级1ml，注入平皿，立即倾注营养琼脂培养基，待凝固后置33℃细菌阳性培养箱中培养24～72h，逐日观察结果并记录；金黄色葡萄球菌10-7级、大肠埃希菌10-7级方法同枯草芽孢杆菌。取0.9%无菌氯化钠溶液1ml，白色念珠菌10-5级1ml，分别注入平皿，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后置25℃阳性霉菌培养箱中培养5d，逐日观察结果并记录。黑曲霉10-6级菌悬液方同白色念珠菌。

2.4.6 实验结果 从表2可知，3次平行试验枯草芽孢杆菌、大肠埃细菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉的试验组和稀释剂对照组的回收率均大于70%，根据《中国药典》2010版规定，可以采用常规法测定供试品中细菌、霉菌和酵母菌数。

2.5 控制菌（大肠埃希菌）检查方法验证

2.5.1 常规法 按照2010年版《中国药典》规定需进行3次独立的平行试验，且每次每种菌种需平行2皿

2.5.2 试验组 取已灭菌的装有100ml胆盐乳糖培养基的三角瓶一瓶，用无菌移液枪加入1∶10供试液10ml，10-7级大肠埃希菌菌悬液10ml，置35℃阳性培养箱中培养24h，按大肠埃希菌的检查法检查。

2.5.3 阴性对照组 取已灭菌的装有100ml胆盐乳糖培养基的三角瓶一瓶，用无菌移液枪加入0.9%无菌氯化钠溶液10ml，置35℃阴性培养箱中培养24h，按大肠埃细菌的检查法检查。

2.5.4 阳性对照组 取已灭菌的装有100ml胆盐乳糖培养基的三角瓶一瓶，用无菌移液枪加入10-7级大肠埃希菌菌悬液10ml，置35℃阳性培养箱中培养24h，按大肠埃希菌的检查法检查。

2.5.5 供试品组 取已灭菌的装有100ml胆盐乳糖培养基的三角瓶一瓶，用无菌移液枪加入1∶10供试液10ml，置35℃阳性培养箱中培养24h，按大肠埃希菌的检查法检查。

2.5.6 阴性菌对照组 阴性对照菌采用10-7级金黄色葡萄球菌，方法同试验组。

2.5.7 实验结果 由表3可知，大肠埃希菌阳性组、试验组生长良好，说明止咳枇杷颗粒对大肠埃希菌无抑菌作用或抑菌作用较弱，可以采用常规法检查。

3 结果与讨论

3.1 上述验证结果 止咳枇杷颗粒采用常规法测定细菌、霉菌及酵母菌的试验组和稀释剂对照组回收率均大于70%，说明可以采用常规法对细菌、霉菌、酵母菌及控制菌中大肠埃希菌进行检验且采用0.9%无菌氯化钠溶液作为稀释剂对试验不产生影响。

3.2 方法验证中阳性菌会造成环境污染 必须严格按照2010年版《中国药典》附录中方法验证的规定，在无菌室的生物安全柜内操作，做好防护措施。同时供试品组及阴性对照组应在符合规定的洁净室内操作。

3.3 方法验证需进行三次独立的平行实验 为使结果获得良好的重现性，所加的培养基体积应尽量一致，培养基与所加试液应充分混合均匀。

3.4 菌落计数 菌落计数是方法验证实验过程中极为重要的一步，因此计数时应仔观察，必要时可借助放大镜等工具，排除药渣和小气泡的干扰，减少操作误差。

参考文献

[1] 南京中医药大学.中药大辞典[M].上海：上海科学技术出版社，2006：833-5553.

[2] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：107-116.

[3] 中国药品生物制品检定所，中国药品检验总所.中国药品检验标准操作规范[S].北京：中国医药科技出版社.2010：351-369.

（收稿日期：2015.04.02）