基于文献挖掘的中医证候生物学基础初步研究

刘婧玮 翟兴 冯玄超 高阔 赵慧辉 陈坤 刘甲 陈建新

摘要：目的 以中医常见证型气虚证为切入点，从生物分子网络角度探索中医证候生物学基础。方法 建立神经-内分泌-免疫（NEI）相关基因数据字典及气虚证表征术语词库，并通过Genclip软件检索气虚证表征文献并挖掘气虚证特征性NEI基因，探索证候的生物活性物质。结果 对挖掘出的基因数据进行分析显示，“气虚证”相关基因与内分泌、细胞信号传导、造血细胞系、免疫缺陷等相关。中医证型的内在生物学特征可以在NEI水平上进行有效的辨识。结论 文献挖掘作为一种新的发现证候生物学指标的方法具有一定的可行性，建议将其扩大到其他证型的研究中，验证该方法的普适性和可靠性。

关键词：中医证候；气虚证；文献挖掘；生物学基础；神经-内分泌-免疫

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.013

中图分类号：R2-05 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）07-0043-04

中医学的基本特点在于整体观和辨证论治，以病证结合、方证相应，即“病证方”结合的诊疗模式为特色。证（证候）的生物学基础则是中医药现代化的关键，目前研究较多的有血瘀证、肾阳虚证、寒证、热证等，并形成了证本质研究、证实质研究、证候客观化等多个学术生长点，如阴黄证和阳黄证的代谢组学发病机制[1]，为阐释中医证候的生物学本质，证的诊断客观化、规范化和病证分型治疗提供依据。

基金项目：国家自然科学基金面上项目（81173463）；北京市青年英才计划（YETP0821）

通讯作者：陈建新，E-mail：Cjx@bucm.edu.cn

气虚证是中医常见证型，可见于研究深入的几大疾病中，如冠心病、心力衰竭、糖尿病等[2-7]，临床常见检验方法已对上述疾病进行诊断。研究表明，这些常见病与神经-内分泌-免疫（NEI）密切相关[8]。本研究以NEI网络相关基因为基础，以气虚证为切入点，通过文献挖掘方法初步得到了气虚证基于NEI网络特有的生物活性物质，对阐明证候的客观性，揭示证候、疾病中分子相互作用机制有着重要意义，为揭示证候的科学内涵奠定了方法学基础。

1 资料与方法

1.1 收集表征术语关键词

以中华人民共和国国家标准《中医临床诊疗术语》为主要依据收集、整理出11个“气虚证”的表征术语关键词，包括气虚、隐痛、钝痛、气短、乏力、神疲、懒言、头晕、自汗、舌淡、脉虚。

1.2 文献挖掘方法

从dbNEI（http：//166.111.130.62/portal/root/ bi_dbnei/download.jsp）数据库上下载NEI相关基因（共2242个与NEI相关的基因），载入Genclip软件中，然后使用该软件的“Word related Gene Search”功能在文献库中挖掘与给定表征术语相关的NEI基因，并使用“Literature Mining Gene Networks”功能构建气虚证每个表征术语的基因网络。分别比较挖掘出的与气虚证各关键词相关的基因，找出同时出现在2个关键词及以上的那些基因，由于这些基因至少同时在某一证候的2种表征中出现，那么，他们就很可能与该证候有一定联系而非只和单一表征有关，即与气虚证有联系。

1.3 基因分析方法

应用DAVID Bioinformatics Resources 6.7软件[9]对所得基因进行分层聚类、基因类型测试和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路分析。基因聚类测试是一种探索性的工具，用以探索检测基因表达数据内部的关联性，为进一步考虑进行假设性的筛选。KEGG通路分析可以帮助寻找所提供基因所参与的生物过程。

2 结果

文献挖掘结果显示，气虚的11个关键词中有5个挖掘出与之相关的基因，具体关键词及挖掘出的基因个数见表1；通过比较气虚证与各个关键词相关的基因，找出了15个同时出现在2个关键词及以上的基因，见表2。脉虚、自汗、头晕、气虚关键词基因网络见图1。

表1 气虚证关键词对应的基因数目

关键词 基因个数

气虚 21

呼吸困难 95

头晕 63

脉虚 4

自汗 4

表2 同时出现在2个表征术语及以上的基因

编号 气虚基因 出现次数

1 IL6（白细胞介素6） 4

2 IL10（白细胞介素10） 4

3 IL2（白细胞介素2） 3

4 IL1B（白细胞介素β） 3

续表2

编号 气虚基因 出现次数

5 IFNG（干扰素γ） 3

6 POMC（阿黑皮素） 3

7 ADIPOQ（脂联素） 3

8 IL8（白细胞介素8） 3

9 IL5（白细胞介素5） 2

10 CD14（细胞表面分化抗原14） 2

11 CD79A（细胞表面分化抗原79-α） 2

12 FGF2（成纤维细胞生长因子） 2

13 CD40LG（细胞表面分化抗原40配体） 2

14 NPPB（脑钠肽） 2

15 LEP（人瘦素） 2

脉虚 自汗

气虚

头晕

图1 气虚证关键词基因网络

3 讨论

1973年，Isakovi?[10]和Jankovi?[11]通过双边对称电解損伤大鼠大脑不同部位（下丘脑、脑干网状结构、丘脑、上丘、尾状核和杏仁复合体），并观察其对淋巴器官的影响后，首次提出了NEI三大系统之间的关系。NEI网络学说的提出和发展，与几千年来中医理论提倡的整体观念可谓不谋而合，并在一定程度上为来源于长期临床实践的中医理论提供了现代医学证据。1990年，高氏[12]和王氏[13]将NEI网络与中医理论相联系，并引起了中医界的广泛关注。因此，我们认为借助NEI网络，可以更好地理解中医，进一步实现中医的现代化与国际化。

网络是复杂生物系统的表现方式，网络的复杂性本质上就是“关系”的复杂性。正是系统生物学以上研究模式与策略的变革与进步，使从生物分子网络角度探索证候的生物学基础具备了现实可行性。中医药现代研究中，不少学者曾对NEI网络、分子网络调节和细胞因子网络等问题进行了思考[14-16]，提示中医药现代研究需突破单生物学指标的局限，充分考虑机体内部复杂的相互联系，强调了中医药现代研究突破“还原论”的重要性。然而，由于“系统”相关的数据尚未完善，以及建模、仿真和分析等“计算”能力的缺乏，既往的“网络”往往局限于现象描述，侧重于理论与概念分析。近年来，“系统生物学”的新兴，海量数据获取技术（如“组学”），尤其是计算分析能力和系统建模等方法的迅速发展，给“生物网络”赋予了丰富的、实质性的内涵，并迅速成为国际生命科学与医学研究的新热点。多学科专家开始致力于从海量数据中寻找实现生命功能或导致疾病的内在网络系统，了解其时空变化及系统性质，并发展控制措施。例如，2005年提出了“网络生物学”[17]，同年《Cell》首次刊登了人类的蛋白质相互作用网络[18]。系统生物学以建立可预测、可预防和个体化的新的医学诊疗体系为目的[19]，其中基因表达调控网络、蛋白质/蛋白质相互作用网络、信号转导网络及代谢网络等生物网络的研究则是理解“系统”的关键。与此同时，计算与实验相交融的系统生物学研究策略和生物信息学方法，在生物网络的研究中正发挥着越来越重要的作用，成为生命科学和医学研究从“还原论”走向“系统论”及从“描述性”转为“预测性”的一个重要标志。

Genclip是一种文献挖掘软件，可对基因芯片的差异表达基因进行特定的功能聚类，以及构建特定功能的基因网络[20]。将每个基因导入软件，不仅能显示出该基因诸多的名称，也能给出该基因的功能注释和文献摘要。使用者还可以根据自己的研究方向添加和组合关键词，然后进行基因与基因之间关系的挖掘，最后得出的是基于待分析基因和指定关键词的信号通路（网络）。该软件利用的文献是不断更新的，所以挖掘的基因与关键词的关系总是处于不断更新中，挖掘出来的疾病机制也总是最新的。本研究从复杂生物网络的角度切入，以中医辨证的常见证型——气虚证为例，通过挖掘与证候表征相关的基因而构建证候的生物分子网络，从不同角度进行证候生物分子网络构建的研究，通过分析、整合NEI的典型调控环节，以及激素、细胞因子、神经递质的相互作用，探索气虚证的生物学基础。通过比较、分析文献挖掘的数据，我们发现气虚相关集群与内分泌、信号传导、造血细胞系、炎症反应等相关，从而表明本方案可以对中医证型的内在生物学特征进行有效地辨识。

文献挖掘作为一种即省时、省力又简单易行的挖掘证候生物学指标的方法，也正在被越来越多的研究人员所采纳。但作为一种新的挖掘证候生物学指标的方法来说，本研究还存在一些不足，主要表现为研究“深度”和“广度”不足两个方面：“深度”方面，实验所采用的文献挖掘方法挖掘出的基因的准确性还未达到非常理想的程度，后期可以考虑引入更多的挖掘方法进行对比分析，以提高挖掘的准确度；而“广度”方面，本研究仅对气虚证进行了系统研究，下一步还需要扩大到其他证型的研究中，从而进一步验证该方法的普适性和可靠性。

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（收稿日期：2014-10-27）

（修回日期：2014-12-05；编辑：华强）