大孔树脂纯化飞龙掌血总生物碱的工艺研究

刘思艺

【摘 要】 目的：[SS]对大孔树脂纯化飞龙掌血总生物碱的工艺条件进行初步探索。方法：[SS]采用紫外-可见分光光度法，以总生物碱吸附率、解吸率为评价指标，通过考察树脂类型、原料液质量浓度、p值、上样体积流量、解吸溶剂及绘制树脂静态吸附平衡曲线、泄露曲线，综合评判优化工艺。结果：[SS]AB-8树脂富集纯化效果较好，其对飞龙掌血总生物碱的适宜吸附和解吸条件为：吸附原料液质量浓度为02g/ml，p 值为.0～6.0，上样体积流量为3BV/h；解吸先用2BV水除杂，再依次用BV 10%、20%、30%、40%、0%、60%乙醇洗脱。结论：[SS]AB-8树脂可用于飞龙掌血总生物碱的纯化，该方法具有操作简单、成本低廉等特点。

【关键词】 可飞龙掌血；总生物碱；大孔树脂；纯化

【中图分类号】R96 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-817（201）1-0013-02

龙掌血又名见血飞，为芸香科飞龙掌血属植物飞龙掌血（oddalia asiatica Lam）的干燥根或根皮，始载于《植物名实图考》，是贵州苗族习用药材。其味辛，微苦，性温；入肝、肺经。临床主要用于感冒、胃气痛、胸胁痛、风湿性关节炎、跌打损伤、月经不调、劳伤吐血、疮疖肿痛、毒蛇咬伤、外伤出血等[1-2]。现代研究表明其具有抗A型流感病毒活性、抑制白色念珠菌、痢疾杆菌等细菌、抗心肌缺血等作用[3-6]，研究前景广阔。总生物碱作为其一个有效部位群，占药材分离物的4.% [7]，有明显的抗炎、镇痛、止血活性[8-9]，目前尚无优选飞龙掌血总生物碱富集纯化研究的报道。酸性染料比色法可对总有效部位进行含量测定，已有用于飞龙掌血提取物中总生物碱含量的测定[10]。本实验系统考察7种大孔树脂对飞龙掌血总生物碱的吸附、解吸性能，并对筛选出的AB-8树脂的纯化工艺做进一步的研究，确定了适宜的吸附、解吸的工艺条件。[JP]

1 材料与仪器

1.1 仪器 WFZ UV-2100型紫外-可见分光光度计（尤尼柯仪器有限公司）；XS22A 型分析天平（瑞士普利赛斯公司）；GKC21CR4型可控硅恒温水浴锅（上海锦屏仪器仪表有限公司）；MD200-2型氮气吹扫仪（杭州奥盛仪器有限公司）。

1.2 试剂与材料 柠檬酸固体、溴百里香草酚蓝、十二水磷酸氢二钠（天津市大茂化学试剂厂）；乙醇、甲醇（天津市百世化工有限公司）；三氯甲烷（衡阳市凯信化工试剂有限公司）；氢氧化钠（广州市海珠区化学试剂厂）；无水硫酸钠（天津市致远化学试剂有限公司），所用试剂均为分析纯。DA-201、NKA-II、DM-301、DM-130、NKA-9、AB-8、D-101大孔吸附树脂（天津市海光化工有限公司）。

1.3 药品 盐酸小檗碱对照品（批号：0713-200208，中国药品生物制品鉴定所）；飞龙掌血药材购自广州致信中药饮片有限公司，经广州中医药大学周劲松副教授鉴定为芸香科植物飞龙掌血oddalia asiatica Lam的干燥根。

2 方法与结果

2.1 分析方法[10]

2.1.1 对照品溶液的制备 取小檗碱对照品适量，精密称足，置称足量瓶中，加甲醇溶解并稀释成每1ml含小檗碱0μg的对照的溶液。精密吸取浓度为0μg·ml-1小檗碱对照品溶液3.0ml，空气吹干后精密加入酸性染料溶液4.0ml及4.0ml缓冲液，用10.0ml氯仿萃取，加少量无水硫酸钠吸水。

2.1.2 阴性溶液的制备 精密吸取酸性染料溶液4.0ml及缓冲溶液4.0ml，加10.0ml氯仿萃，加少量无水硫酸钠吸水。

2.1.3 供试品溶液的制备 按单因素考察和正交试验得出的提取方法，取飞龙掌血药粉（40目）约10g，2倍量7%乙醇，7℃水浴回流提取40 min，提取液浓缩至无醇味，取上清液，稀释至适宜的质量浓度，备用。精密吸取原液。经静态和动态吸附后药液适量，20ml量瓶中按对照品溶液的制备方法项下操作。

2.1.4 波长选择 分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性溶液进行全扫描，记录吸收曲线，对照品和供试品的吸收曲线形状一致，均在波长418nm处有最大吸收，阴性溶液无干扰，故选择418nm为测定波长。

2.1. 标准曲线的绘制 精密吸取盐酸小檗碱对照品储备液（0μg·ml-1）0.6、1.2、1.8、2.4、3.0、3.6ml于锥形瓶中，自“空气吹干按“对照品溶液的制备方法操作，418nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，得回归方程为Y=0.044X+0.00，r=0.9991。线性范围2.87～22.91μg·ml-1

2.1.6 测定方法 精密吸取原液、经静态和动态吸附后药液适量，置20ml量瓶中，按“标准曲线的绘制项下操作，计算总生物碱的量。

2.2 树脂的筛选

2.2.1 树脂的预处理 分别取上述7种大孔吸附树脂，在使用前一晚用蒸馏水浸泡洗至无醇味，备用。

2.2.2 碱静态吸附率比较 精密称取各树脂2.g（湿重），置10ml具塞三角瓶中，加入制备好的样品溶液（0.4g/mL）20ml，置于恒温摇床中振摇24h后，测定样品液中总生物碱含量，计算树脂吸附率。上述7种树脂吸附后，依次加入水10mL、7%乙醇2ml×2次，置于恒温摇床中依次振摇24h，测定各解吸液中总生物碱含量，计算解吸率。结果见表1。综合考虑吸附率和解吸率，选用AB-8型大孔树脂作为总生物碱纯化的载体。

2.3 AB-8型大孔树脂纯化飞龙掌血总生物碱工艺参数

2.3.1 浓度对树脂吸附率的影响 取预处理树脂适量（相当于干树脂约1.0g），精密称定，分别加入0.2、0.4、0.6 g/ml的样品液20.0ml，置于恒温摇床中振摇24h，测定树脂的静态吸附率，吸附率分别为7.62%，0.00%，4.2%。因此飞龙掌血总生物碱的最佳吸附浓度为0.2g/ml。

2.3.2 p值对树脂吸附率的影响 将浓度0.2g/ml样品溶液调成p值为4.0、.0（原液）、6.0、7.0和8.0的溶液，分别精密吸取20.0ml，置装有预处理树脂（相当于干树脂约1.0g）的具塞三角瓶中，恒温摇床中振摇24h，测定树脂的静态吸附率，分别是79.24%、82.94%、83.29%、80.82%、79.14%，上样液最佳p值为.0～6.0，用原药液上样即可。

2.3.3 树脂静态吸附平衡曲线的测定 取预处理树脂适量（相当于干树脂约1.0g），精密称定，加入浓度0.2g/ml样品液20ml，置于恒温摇床中振摇，分别于0.、1、2、3、4、6、8、12、24h取样，测定AB-8大孔树脂对总生物碱的吸附率，以吸附率对时间作图，绘制AB-8树脂对总生物碱的静态吸附平衡曲线。由图1可知，吸附4h后树脂对总生物碱吸附率基本不再变化，说明AB-8型树脂对总生物碱的吸附速度较快，4h即达到吸附平衡。

2.3.4 流速对树脂吸附量的影响 将等量的0.2g/ml样品液分别以1.0、2.0、3.0、4.0、.0 BV/h的流速通过树脂层析柱，考察不同流速对树脂吸附量的影响。结果吸附量依次为88.34、87.66、87.82、84.9、74.77mg/g，表明AB-8型树脂对总生物碱的最佳吸附流速为3BV/h。

2.3. 总生物碱在AB-8树脂上的泄露曲线 将0.2g/ml的样品溶液加到AB-8树脂层析柱中进行动态吸附，流速3BV/h，按保留体积分段收集流出液，并测定各段流出液中总生物碱的浓度，以流出液中总生物碱浓度对上样体积作图，绘制泄露曲线。由图2可知，第 9个保留体积液中总生物碱明显增多，说明上样至第8个保留体积时总生物碱开始明显泄漏。综合考虑，选择上样量为8BV。

2.3.6 洗脱方法的考察 向充分吸附飞龙掌血提取液后的AB-8大孔树脂中加入2BV水，置于恒温摇床中振摇24 h后，测定水解析液中总生物碱含量。再向水解吸后树脂中依次加入各BV不同浓度的乙醇（10%、20%、30%、40%、0%、60%、70%），同法操作，测定醇解析液中总生物碱的含量，结果见表2。考虑成本，确定洗脱方法为水洗脱后，依次用BV 10%、20%、30%、40%、0%、60%乙醇洗脱。

2.4 工艺验证 根据上述确定的树脂类型和工艺条件，用3根树脂柱同时进行纯化试验，初步确定飞龙掌血生物碱纯化工艺为：采用AB-8大孔树脂，湿法装柱，上样药材浓度为0.2g/ml，p 值 .0～6.0，药材与干树脂质量之比为 2.3∶1，室温下以 3.0 BV/h 的体积流速进行吸附饱和。解吸时，先以2BV 的水洗脱（弃去），再依次用BV 10%、20%、30%、40%、0%、60%乙醇洗脱。吸附率80.27%，解吸率为72.87%，生物碱纯度从9.1%提高至为39.09%，工艺稳定可行。

3 讨论

本文围绕大孔树脂纯化的“上样-吸附-洗脱步骤进行考察，设定的工艺参数便于实际操作与应用。醇解吸前先用水洗脱杂质、色素等，但水对飞龙掌血生物碱有一定的解吸作用，为了生物碱收率需要控制洗脱用水量。其结果表明试验方案证可行，对工业生产有一定指导意义。

在酸性染料法测总生物碱含量的操作时应注意避光，且不同p对结果影响较大。在预实验中对缓冲溶液的p值进行了考察，配制p分别为4、4.、、.的缓冲溶液，在其他条件相同时对同提取液进行萃取分离，检测其含量，结果显示当p为.时总生物碱的含量最高，所以严格控制水相p为.。

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（收稿日期：201.04.20）