龙眼胚性愈伤组织中ELF4家族基因克隆及其表达分析

陈裕坤 林玉玲 赖钟雄

摘 要 ELF4家族是植物特有基因，能调节生物钟、调控开花时间、感受光周期和参与幼苗去黄化等。以龙眼松散型胚性愈伤组织为材料，采用RT-PCR结合RACE法克隆了ELF4家族3个成员cDNA全长，分别命名为DlELF4、DlELF4-LIKE 1和DlELF4-LIKE 4。DlELF4全长599 bp，编码140个氨基酸；DlELF4-LIKE 1全长762 bp，编码142个氨基酸；DlELF4-LIKE 4全长661 bp，编码114个氨基酸；DlELF4家族成员均为不稳定的亲水蛋白，无信号肽与跨膜结构，都含有DUF1313保守功能结构域。进化树分析表明，植物中ELF4家族可分成二个亚组，ELF4与ELF4-LIKE 1聚为一组，ELF4-LIKE 2、3、4聚为另一组。qPCR结果表明：在体胚发生过程中DlELF4、DlELF4-LIKE 1和DlELF4-LIKE 4表达模式相同，均在球形胚时期表达量极高，而在其它时期表达量很低；DlELF4家族对不同光质和不同处理时间的响应存在差异：DlELF4的表达经24 h处理时可能受绿光和红光诱导，经72 h处理时可能受红光、蓝光和白光诱导；DlELF4-LIKE 1的表达在24 h处理时可能受绿光诱导，经72 h处理时受红光和绿光抑制；DlELF4-LIKE 4的表达在24 h和72 h处理时可能受蓝光和白光诱导。水杨酸和茉莉酸甲酯能促进龙眼胚性愈伤组织中DlELF4家族成员的表达。以上结果表明，ELF4家族可能参与龙眼体胚发生过程中球形胚的形态建成与胁迫应答。

关键词 龙眼；体胚发生；ELF4家族；克隆；表达分析

中图分类号 S602.3 文献标识码 A

Cloning and Characterization of ELF4 Family Genes from

Embryogenic Callus in Dimocarpus longan Lour.

CHEN Yukun， LIN Yuling， LAI Zhongxiong*

Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract ELF4 family has not been detected outside the plant kingdom， and it is involved in the promotion of circadian clock， flowering time， photoperiod perception and seedling de-etiolating. The RT-PCR combined with RACE method was used to obtain the complete 3 cDNA sequences of ELF4 family's from the embryogenic callus in Dimocarpus longan. The complete cDNA sequence of DlELF4 was 599 bp， encoding 140 amino acids， and that of DlELF4-LIKE 1 and DlELF4-LIKE 4 was 762 bp， encoding 142 amino acids， and 661 bp， encoding 114 amino acids， respectively. DlELF4， DlELF4-LIKE 1 and DlELF4-LIKE 4 were unstable and hydrophilic proteins， without signal peptides and transmembrane structures， but had the DUF1313 protein function domain. Anglicizing phylogenetic tree of ELF4 family in plants indicated that ELF4 family can be divided into two subgroups. ELF4 and ELF4-LIKE 1 was gathered as one group， while ELF4-LIKE 2， 3 and 4 were clustered into another group. qPCR results indicated that DlELF4 family showed the same expression pattern during the somatic embryogenesis， they expressed at the highest levels in the globular embryos， but very low levels in other embryogenic stages. DlELF4 family showed different responses with different light quality and treatment time. DlELF4 may be induced by the green and red light after 24 h treatment and may be induced by the red， blue and white light after 72 h； DlELF4-LIKE 1 may be induced by the green light after 24 h treatment， but may be suppressed by the red and green light after 72 h； DlELF4-LIKE 4 may be induced by the blue and white light after 24 and 72 h treatment. DlELF4 family makes the positive response with SA and MJ treatment. The above results showed that ELF4 family might participate in globular embryoid's morphogenesis during somatic embryogenesis and stress responses.

Key words Longan； Somatic embryogenesis； ELF4 family； Cloning； Expression analyzing

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.09.008

EARLY FLOWERING 4（ELF4）最早由Doyle于2002年发现并命名的[1]，该基因主要参与植物的光周期感知、生物钟调节，不仅能提升植物生物钟的精度，在缺少昼夜周期时对生物节律的维持又是必不可少的[1-4]；elf4突变体中中央振荡器元件CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1（CCA1）的表达量减弱[1]。ELF4家族是一个植物特有的基因家族，在拟南芥中还包括4个同源基因ELF4-LIKE 1（EFL1）、ELF4-LIKE 2（EFL2）、ELF4-LIKE 3（EFL3）、ELF4-LIKE 4（EFL4），他们都具有DUF1313功能结构域，但其功能仍然未知[1，5-6]。ELF4的表达被光敏色素B调控，参与幼苗的去黄化、生物钟调节和光周期感受等过程[1，5]。在光照下，ELF4促进CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1（CCA1）和LATE ELONGATED HYPOCOTYL（LHY）的表达，而CCA1和LHY抑制ELF4的表达[3，7]；ELF4、EARLY FLOWERING 3（ELF3）及LUX ARRHYTHMO（LUX）组成的蛋白复合体调控PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR 4（PIF4）和PIF5的表达，进而调控植物的生长[8]。ELF4还能调控拟南芥的开花时间，在非诱导的光周期条件下elf4突变体的早花现象可能是由于CONSTANS（CO）的大量表达所引起的。在拟南芥中ELF4蛋白通过控制GI（gigantea）的亚细胞定位来调控开花[9]，而GI能够结合到CO基因的启动子上来调控CO的表达[10]。Adeyemo等[11]的研究表明过量表达木薯MeELF4可以使拟南芥elf4突变体的开花时间和下胚轴恢复正常。

目前，龙眼中ELF4家族的功能未知，ELF4家族与体胚发育过程的相互关系更是未见报到。近年来，本实验室借助多种分子生物学手段，已对龙眼体胚发生过程开展多项研究，如采用Solexa测序技术对龙眼体胚发生过程中的miRNAs进行鉴定[12]，得到部分与已知的miRNAs相似的序列；建立了龙眼胚性愈伤组织转录组数据库等[13]。本研究在这些工作的基础上，分离和克隆了龙眼胚性愈伤组中ELF4、ELF4 LIKE 1和ELF4 LIKE 4的cDNA全长序列，借助生物信息学分析方法初步推测龙眼胚性愈伤组织ELF4家族的功能，预测调控ELF4的潜在miRNAs，研究其在体胚发育的不同阶段、不同光质处理和不同浓度水杨酸及茉莉酸甲酯处理下的表达模式，为探讨DlELF4家族的功能等后续研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料及RNA提取与cDNA合成

龙眼松散型胚性愈伤组织（‘红核子品种LC2细胞系）由福建农林大学园艺植物生物工程研究所提供[14-16]。按龙眼体胚发生同步化调控的方法，获得松散型胚性愈伤组织、不完全胚性紧实结构、球形胚、鱼雷形胚和子叶形胚5个不同发育阶段的胚性培养物[17-18]。以培养18 d的龙眼胚性愈伤组织为材料，分别接种在含有（0、50、75、100 μmol/L）水杨酸（SA）和（0、50、75、100、150 μmol/L）茉莉酸甲酯（MJ）的液体培养基中黑暗振荡（120 r/min，25 ℃）培养24 h，分别在不同光质（黑暗、红光、绿光、蓝光和白光）下培养24 h和72 h。取以上材料作为实时荧光定量PCR的试验材料。龙眼胚性愈伤组织转录组SRR accession numbers：SRA050205。参照赖呈纯等[19]和李惠华等[20]的方法，提取龙眼胚性愈伤组织总RNA，用于合成RT-PCR的cDNA。

1.2 方法

1.2.1 引物设计及PCR扩增 3′-RACE和5′-RACE：采用RACE法，根据转录组分析所得的序列分别设计2条3′-RACE引物，结合GeneRacerTM 3′Primer和GeneRacerTM 3′Nested Primer引物，以龙眼松散型胚性愈伤组织cDNA为模板，进行巢式PCR反应扩增3′未端序列；根据转录组分析所获得序列分别设计2条5′-RACE引物，并结合GeneRacerTM 5′Primer和GeneRacerTM 5′Neste Primer引物，以龙眼松散型胚性愈伤组织cDNA为模板，进行巢式PCR反应扩增5′未端序列。

拼接验证：对转录组分析所得序列、3′未端序列和5′未端序列的测序结果进行全长拼接，设计拼接验证引物，PCR反应验证拼接结果。以上引物均由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。所有引物的名称、引物序列及扩增用途见表1。

PCR反应体系和扩增程序参照赖呈纯等[19]和李惠华等[20]的方法，根据扩增不同的目的片段，对PCR扩增程序进行相应的调整。获得目的片段后切胶回收，TA克隆后挑取阳性克隆子的菌液进行PCR扩增，将阳性菌液送华大基因公司测序。

1.2.2 生物信息学分析 ExPASy Protparam预测蛋白质理化性质；SignalP 4.0 Server预测蛋白质信号肽；以PSORT Prediction（plant）进行亚细胞定位预测；EMBnet TMpred预测蛋白质跨膜结构；NetPhos2.0预测蛋白质磷酸化位点；PredictProtein在线预测其它功能位点；经InterPro预测蛋白质保守结构域，以PSIPRED预测蛋白质二级结构；Mega6.06 Neighbor-Joining（邻位相连法，NJ法）构建核苷酸序列的分子系统进化树（P-distance法），并用bootstrap法（重复1 000次）评估系统进化树。为了解miRNA与DlELF4家族的相互调控关系，本研究以Lai等[12]新鉴定的龙眼中保守或特异的miRNA序列为探针，以DlELF4家族3个成员的核酸序列为靶基因预测的候选序列，采用psRNA Target在线软件，预测潜在调控DlELF4家族成员表达的miRNA。

1.2.3 龙眼体胚发生不同阶段DlELF4家族成员的表达分析 参照Lin等[21]建立的多基因内参体系，以检测龙眼胚性愈伤组织中DlELF4家族成员在体胚发生不同阶段的表达情况。本试验采用LightCycler480仪器和Takara SYBR ExScriptTM试剂，以龙眼体胚（松散型胚性愈伤组织、不完全胚性紧实结构、球形胚、鱼雷形胚和子叶形胚）5个阶段的cDNA稀释后作为模板，根据荧光定量PCR引物设计基本原则设计DlELF4家族成员的上下游引物进行qPCR扩增。将试验中5个时期的cDNA模板的混合样进行5倍梯度系列稀释制作标准曲线。根据软件自动分析的DlELF4家族成员标准曲线的斜率可得PCR扩增效率（E），E=10（-1/slope）。qPCR反应体系和扩增程序参照Lin和Lai的方法[21]。待反应结束后进行扩增曲线、溶解曲线（60～95 ℃）和凝胶电泳分析，检测引物特异性；每个反应包括3个重复，根据扩增曲线计算Ct值，并获得不同阶段DlELF4家族成员的mRNA相对含量，通过内参基因的校正最终得到目的基因的相对表达量。

1.2.4 不同光质和不同浓度水杨酸、茉莉酸甲酯处理后DlELF4家族成员的表达分析 参照Lin等[21]建立的多基因内参体系，以检测龙眼胚性愈伤组织在不同光质（黑暗、红光、绿光、蓝光和白光）处理24 h和72 h后DlELF4家族成员的表达情况，以及在不同浓度（0、50、75、100 μmol/L）水杨酸和（0、50、75、100、150 μmol/L）茉莉酸甲酯处理24 h后的表达情况。

2 结果与分析

2.1 龙眼胚性愈伤组织DlELF4家族成员cDNA全长序列获得及其序列分析

将龙眼转录组数据[13]中3条注释与ELF4相关的核苷酸序列（Unigene54774、Unigene5551、Unigene51684）及其推导的氨基酸序列分别在NCBI上经Blastn和Blastp分析，均与数据库中已有的ELF4基因家族的核苷酸和氨基酸序列具有较高的同源性，初步推断这些片段为龙眼胚性愈伤组织中DlELF4基因家族的部分cDNA序列。

根据转录组测序所获得的已知序列，分别设计3′-RACE和5′-RACE引物，采用RACE法扩增DlELF4家族成员的3′末端序列和5′末端序列，经二轮PCR后均可扩增出与预期相符的片段。测序结果表明：DlELF4的5′-RACE片段大小为314 bp，3′-RACE片段大小为168 bp；DlELF4-LIKE 1的5′-RACE片段大小为263 bp，3′-RACE片段大小为421 bp；DlELF4-LIKE 4的5′-RACE片段大小为224 bp，3′-RACE片段大小为353 bp。经DNAMAN6.0拼接，DlELF4、DlELF4-LIKE 1、DlELF4-LIKE 4的cDNA全长分别为：599、762、661 bp；采用RT-PCR法对拼接结果进行验证，测序结果表明DlELF4、DlELF4-LIKE 1、DlELF4-LIKE 4的序列长分别为：423、429、345 bp，与拼接结果相符合。DlELF4、DlELF4-LIKE 1、DlELF4-LIKE 4的GenBank登录号分别为KJ480950、KP015057、KP015057。

DlELF4 cDNA全长599 bp，开放阅读框（ORF）423 bp，编码140个氨基酸，5′-UTR为33 bp，3′-UTR为143 bp，PolyA尾巴为42 bp；DlELF4 LIKE 1 cDNA全长762 bp，ORF 429 bp，编码142个氨基酸，5′-UTR为52 bp，3′-UTR为281 bp，PolyA尾巴为24 bp；DlELF4 LIKE 4 cDNA全长661 bp，ORF 345 bp，编码114个氨基酸，5′-UTR为49 bp，3′-UTR为267 bp，PolyA尾巴为22 bp。

2.2 龙眼胚性愈伤组织DlELF4家族的生物信息学分析

利用ExPASy Protparam预测其DlELF4、DlELF4-LIKE 1和DlELF4-LIKE4的理化性质，见表2。SignalP4.0 Server和EMBnet TMpred软件预测可知DlELF4、DlELF4-LIKE 1和DlELF4-LIKE4都没有信号肽和跨膜结构。经PredictProtein亚细胞定位预测可知DlELF4定位于叶绿体基质、DlELF4-LIKE 1定位于细胞核，DlELF4-LIKE 4定位于细胞质中。根据NetPhos 2.0预测，DlELF4含有15个蛋白磷酸化位点（Ser：14，Thr：1，Tyr：0），DlELF4-LIKE 1含有11个蛋白磷酸化位点（Ser：5，Thr：6，Tyr：0），DlELF4-LIKE 4含有5个蛋白磷酸化位点（Ser：4，Thr：0，Tyr：1）；经PredictProtein预测其它功能位点可知，DlELF4含有2个N-糖基化位点、1个cAMP与cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、2个蛋白激酶C磷酸化位点、5个酪蛋白激酶II磷酸化位点；DlELF4-LIKE 1含有2个N-糖基化位点、2个cAMP 与cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、3个蛋白激酶C磷酸化位点、3个酪蛋白激酶II磷酸化位点；DlELF4-LIKE 4含有3个N-糖基化位点、2个酪蛋白激酶II磷酸化位点、2个N-酰基化位点。Introprotein预测表明DlELF4家族成员都含有功能未知的DUF1313保守结构域（图1）。采用PSIPRED在线软件预测蛋白质的二级结构，DlELF4、DlELF4-LIKE 1和DlELF4-LIKE 4主要由无规则卷曲和α-螺旋组成（图2），DlELF4中α-螺旋47.9%、无规则卷曲52.1%、无β-折叠；DlELF4-LIKE 1中α-螺旋43.7%、无规则卷曲56.3%、无β-折叠；DlELF4-LIKE 4中α-螺旋56.1%、无规则卷曲42.1%、β-折叠1.8%。

2.3 ELF4家族的进化树分析

根据NCBI数据库中拟南芥（Arabidopsis thaliana）、可可（Theobroma cacao）、大豆（Glycine max）、甜橙（Citrus sinensis）和葡萄（Vitis vinifera）的相关氨基酸序列，采用Mega6.06软件的邻近相邻法（NJ法）构建ELF4的系统进化树（图3），结果表明ELF4家族可分成二个亚组：ELF4和ELF4-LIKE 1聚为一组，ELF4-LIKE2、3和4聚为另一组；其中，龙眼DlELF4与拟南芥AtELF4的亲缘关系最近，DlELF4-LIKE 1与大豆和甜橙的ELF4-LIKE 1亲缘关系较近；DlELF4-LIKE 4与可可、葡萄的ELF4-LIKE 4亲缘关系最近。

2.4 潜在调控DlELF4家族的miRNA预测

psRNA Target预测结果（表3）表明，DlELF4家族成员受到miRNA的调控。DlELF4同时受到5种miRNA的调控；DlELF4-LIKE 1可能同时受到4种miRNA的调控，DlELF4-LIKE 4可能同时受到7种miRNA的调控。有些miRNA以抑制靶标基因的翻译方式调控DlELF4家族成员的表达，有些则以裂解mRNA的方式抑制靶标基因的表达。一个miRNA可同时调控多个靶标，如miR1535可同时调控DlELF4、DlELF4 LIKE 1和DlELF4 LIKE 4。

2.5 龙眼体胚不同发育阶段DlELF4家族的表达分析

qPCR结果表明，DlELF4、DlELF4 LIKE 1和DlELF4 LIKE 4在龙眼体胚发生过程中的表达模式相同：在松散型胚性愈伤组织和不完全胚性紧实结构阶段的表达量较低，在球形胚阶段的表达量急剧升高并且达到峰值，而在随后的鱼雷形胚和子叶形胚阶段的表达量又急剧下降（图4）。从以上结果可以看出，在龙眼体胚发育过程中，DlELF4、DlELF4 LIKE 1和DlELF4 LIKE 4的转录水平呈现出一定的组织特异性和时空差异，对龙眼体胚的生长和发育可能具有调控功能。

2.6 不同光质处理和不同浓度水杨酸、茉莉酸甲酯处理后DlELF4家族成员的表达分析

qPCR结果表明，不同光质处理24 h后DlELF4的表达量依次为：绿光>红光>白光>蓝光>黑暗，但经过72 h处理后DlELF4的表达量依次为：白光>蓝光>红光>绿光>黑暗，DlELF4的表达在24 h处理时可能受到绿光、红光、白光和蓝光的诱导，其中绿光的诱导最明显，经过72 h处理后可能受到红光、蓝光和白光的诱导；不同光质处理24 h后DlELF4-LIKE 1的表达量依次为：绿光>黑暗>红光>白光>蓝光，但经过72 h处理后白光、蓝光同黑暗处理的表达量相当，绿光下表达量最低；不同光质处理24 h后DlELF4-LIKE 4在红光和绿光处理下的表达量与黑暗处理下表达量相当，在蓝光和白光处理下的表达量比黑暗处理略有增加，经过72 h处理后DlELF4-LIKE 4在蓝光和黑暗下的表达相当且比24 h蓝光处理时略有升高，红光处理下表达量低于蓝光处理，绿光处理的表达量最低，白光处理的表达量达到最高，DlELF4-LIKE 4可能受到蓝光或白光的诱导。说明DlELF4家族成员对不同光质的响应存在差异。

50、75和100 μmol/L的水杨酸处理24 h后，DlELF4家族成员表达量均呈现急剧上升；DlELF4 LIKE 1表达量略有升高，在75 μmol/L时表达量达到峰值；DlELF4 LIKE 4的表达量随着浓度的升高逐渐升高，在100 μmol/L时表达量最大。说明水杨酸能促进龙眼胚性愈伤组织中DlELF4家族成员的表达。不同浓度茉莉酸甲酯处理24 h后，DlELF4家族成员的表达量均明显增加，呈现出先升高后降低又再升高的类“N”状趋势，在50 μmol/L和75 μmol/L时表达量逐渐升高，并在75 μmol/L时表达量达到峰值，随后在100 μmol/L时表达量下降，在150 μmol/L时表达量又略有升高（图5）。说明茉莉酸甲酯能促进龙眼胚性愈伤组织中DlELF4家族成员的表达，在75 μmol/L的浓度下促进作用最明显。

3 讨论与结论

3.1 DlELF4家族成员功能的生物信息学初步推测

植物的生物钟是由许多相互联系的反馈循环网络共同构成的，缺失任何一个组分都会改变中央振荡器的速度。生物钟中枢基因ELF4可正向调节CCA1和LHY的表达，与CCA1/LHY-TOC1循环网络相互联锁，是中央振荡器的核心组分，elf4突变体表现出无节奏的现象[2-3，7]。Herrero等[22]研究发现，ELF4/ELF3和LUX ARRHYTHMO（LUX）复合物是维持植物生物昼夜节律钟的关键。Kima等[23]研究表明ELF4与GI在植物昼夜节律调节等过程中具有协同或累加效应，ELF4与GI通过差异的相位特异遗传影响拟南芥的开花时间、下胚轴伸长和昼夜节律调节等功能。在拟南芥中已证实ELF4基因有着多种功能，例如，ELF4调控着生物节奏、控制着拟南芥的成花[1]，参与了幼苗的去黄化、生物钟功能、和光周期的感受[2，4-5，7，]，控制着拟南芥下胚轴的生长[8]。通过生物信息学分析可知，龙眼ELF4家族的3个成员都是不稳定的亲水蛋白，都没有信号肽和跨膜结构，但都具有DUF1313功能结构域，且N端和C端氨基酸序列变化较大。DlELF4、DlELF4-LIKE 1和DlELF4-LIKE 4亚细胞预测分别定位于叶绿体基质、细胞核和细胞质中。根据进化树分析可知DlELF4和DlELF4-LIKE 1聚为同一亚组，而DlELF4-LIKE 4为另一亚组成员。龙眼ELF4生物信息学分析结果与前人的研究相符合[1-6]，初步推测DlELF4、DlELF4-LIKE 1和DlELF4-LIKE 4为龙眼ELF4家族成员，可能具有生物钟调节、开花时间调控、光周期感受及参与幼苗去黄化等功能。

3.2 ELF4可能参与龙眼体胚发生过程中球形胚的形态建成与胁迫应答

顶端细胞通过几次分裂后形成辐射对称的球形胚胎。此过程中未发生器官分化，唯一分化形成的组织是原表皮层（protodom），它以后在幼苗中形成表皮[24]。球形胚时期原表皮层的分化标志着体细胞胚结构分化的开始。初始前形成层的形成是体细胞胚形态转变的第一个信号[25]。qPCR结果显示，DlELF4、DlELF4 LIKE 1和DlELF4 LIKE 4在龙眼体胚发生过程中的表达模式极其相似，即在其它发育阶段的表达量都很低，只有在球形胚阶段的表达量极高，说明ELF4家族3个成员在龙眼体胚发生过程中可能具有相似的作用，即促进体胚早期阶段的发育，可能与球形胚时期原表皮层的形成有关，表明ELF4家族可能参与龙眼体胚发生过程中球形胚的形态建成。

不同光质处理后24 h和72 h后，DlELF4、DlELF4 LIKE 1和DlELF4 LIKE 4具有不同的表达模式：DlELF4的表达在24 h处理时可能受到绿光和红光的诱导，经过72 h处理后可能受到红光、蓝光和白光的诱导；DlELF4-LIKE 1的表达在24 h处理时可能受到绿光诱导，经过72 h处理时却受到红光和绿光的抑制；DlELF4-LIKE 4的表达在24 h和72 h处理时可能受到蓝光和白光的诱导。说明DlELF4家族成员对不同光质的响应存在差异。不同浓度的水杨酸处理24 h后，DlELF4家族成员表达量均呈现剧烈升高，说明水杨酸能促进龙眼胚性愈伤组织中DlELF4家族成员的表达。不同浓度茉莉酸甲酯处理24 h后，DlELF4家族成员的表达量也出现明显上升趋势，说明茉莉酸甲酯能促进龙眼胚性愈伤组织中DlELF4家族成员的表达。ELF4家族可能参与龙眼体胚发生过程的胁迫应答。当然，植物体内的每一个生理生化现象的机理是十分复杂的，要探索ELF4家族的功能还需要验证其在龙眼活体胚不同发育阶段或龙眼花不同发育时期的表达分析、亚细胞定位、基因功能验证、miRNA的鉴定等后续研究。

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