何首乌饮对衰老大鼠下颌下腺磷酸化cyclinD1蛋白表达的影响

葛志华 崔宙开 杨 宁 李俊玫 王春艳 于海忠 杨佳宁

(承德医学院附属医院科研处，河北 承德 067000)

细胞周期素D1(cyclinD1)是细胞周期的正调节因子，cyclinD1可以和CDK4/CDK6形成复合物并产生蛋白激酶活性，促进G1/S期的转变，加快细胞周期进程。目前，关于cyclinD1过度表达导致细胞失控、癌变的研究很多，而对于cyclinD1与衰老的研究较少。孙洁等〔1〕研究发现菟丝子醇提液可通过影响细胞调控因子p16、cyclinD1表达延缓肝细胞衰老。本文观察何首乌饮对下颌下腺磷酸化cyclin D1的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 OLYMPUS显微镜(日本)，VT1000S振荡切片机(德国Leica公司)，何首乌饮方剂由炙何首乌、怀牛膝、肉苁蓉、淫羊藿、丹参、茯苓六味中药组成，药物均购自承德富尔康药业有限公司，磷酸化cyclinD1抗体(上海迈新生物科技有限公司)。

1.2 何首乌饮给药方法 高、中、低剂量何首乌饮分别为，3.872、1.936 及 0.968 g·100 g－1· d－1，分别水煎浓 缩 成0.6 ml·100 g－1·d－1，灌胃，1 次/d。

1.3 实验动物分组 选用8周龄清洁级SD雌性大鼠90只，体重180～220 g(河北省实验动物中心，合格证编号:605106)，随机分为预防性和治疗性两大实验，预防性实验分为正常组、模型组、何首乌饮预防高、中、低剂量组，治疗性实验分为阴性对照组、自然恢复组、何首乌饮治疗高、中、低剂量组，每组9只。

1.4 各组动物的处理 预防性实验部分:正常组大鼠正常喂养 60 d。模型组腹腔注射 D-半乳糖 0.5 ml·100 g－1·d－1，1次/d，连续60 d。何首乌饮预防高、中、低剂量组大鼠腹腔注射D-半乳糖的同时分别用高、中、低剂量何首乌饮灌胃，1次/d，连续60 d。治疗性实验部分:阴性对照组称重后按0.5 ml·100 mg－1·d－1腹腔注射生理盐水，1 次/d，连续 60 d 后改为生理盐水灌胃(0.6 ml·100 g－1·d－1)60 d;另外4组用 D-半乳糖腹腔注射，1次/d，连续60 d后，取其中3组作为何首乌饮治疗高、中、低剂量组每天分别用高、中、低剂量何首乌饮灌胃，连续60 d;另一组衰老模型作为自然恢复组正常喂养60 d。

1.5 取材、固定及切片的制备 大鼠经10%水合氯醛(0.3 ml/100 mg)腹腔注射麻醉后，开胸，经左心室插管入主动脉，生理盐水冲净血液后4%多聚甲醛灌注、固定取双侧下颌下腺，4%多聚甲醛后固定过夜。常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。连续切片，片厚6μm，每隔30张取相邻5张，裱于APES处理过的载玻片上，置于37℃温箱干燥后进行脱蜡、苏木精-伊红染色、去除组织蛋白等处理，操作完成后封片。

1.6 细胞计数 磷酸化cyclinD1阳性颗粒呈黄色或棕黄色，对磷酸化cyclinD1免疫细胞化学染色的切片，在400倍显微镜下进行阳性细胞计数。每只动物取3张切片，每一切片随机检查3个视野，计算细胞中阳性细胞率。

1.7 统计学处理 采用SPSS11.0统计软件行单因素方差分析及SNK-q检验。

2 结果

磷酸化cyclinD1在正常及实验组大鼠下颌下腺的腺泡细胞、颗粒曲管及其他导管上皮细胞中均有表达，磷酸化cyclinD1阳性颗粒散在分布于细胞质内，呈黄色或棕黄色(图1)。表1可见，预防性实验部分的组间磷酸化cyclinD1蛋白的表达比较有统计学意义(P＜0.01)，正常组最高，模型组最低，各预防组中以预防中剂量组效果最好(P＜0.01)。治疗性实验部分的组间磷酸化cyclinD1蛋白的表达差异有统计学意义(P＜0.01)，阴性对照组最高，自然恢复组最低，各治疗组中以治疗中剂量组最高(P＜0.01)。

表1 各组大鼠下颌下腺磷酸化cyclinD1的表达(x±s，n=9)

图1 各组大鼠下颚下腺磷酸化cyclin D1表达(SDAB，×400)

3 讨论

机体衰老是不可避免的自然现象。衰老时，细胞的增殖能力减退，甚至完全停滞，使功能细胞难以更新，脏器萎缩、功能衰退。细胞周期停滞是细胞衰老的一个关键特征。细胞周期的进程受细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物(CDKI)等调控因子及之间的相互作用调节。细胞周期蛋白在每次间期时被合成，而在有丝分裂时被降解，呈周期性的波动。细胞周期蛋白与细胞衰老关系密切。目前已发现的细胞周期蛋白有十多种，哺乳动物细胞中的 cyclin 分 A、B、C、D(D1、D2、D3)、E 、F、H，其中 cyclinD 是 G1期周期蛋白，在G1期或G1/S期交界处发挥作用，与细胞周期蛋白依赖性激酶 CDK4/CDK6形成复合体催化 RB蛋白磷酸化，Rb蛋白磷酸化后失活，释放E2F，游离的E2F启动G1/S期转换相关基因表达，推动细胞周期的进程。如果抑制cyclinD在G1期表达，细胞将不能进入S期〔2〕。cyclinD过度表达时则可缩短G1期间隔降低细胞对促细胞分裂剂的依赖性〔3〕。

衰老细胞中，一些与细胞周期有关的蛋白质的表达多降低，如cdk2，G2-cyclin(cyclin A 及 B)以及 c-fos、AP-1的表达均降低。对G1-cyclin(cyclin C、D及E)的表达虽无影响，但有研究表明〔4〕，在衰老的人成纤维细胞中CDKI因子增多，cyclinDm-RNA水平比休眠细胞高很多倍，这必然导致过量的cyclinD产生，但多为无活性的cyclinD/CDK4复合物，而磷酸化cyclinD却比休眠细胞少得多，而只有这种磷酸化的cyclinD才可以提高复合物的活性。有活性cyclinD/CDK4复合物少，使Rb蛋白不能磷酸化，则细胞不能通过“R”限制点而阻滞于G1期〔5〕。另有研究表明，衰老细胞中虽然CDK2总磷酸化水平不变，但cyclinD、E-CDK中的磷酸化水平却下降，从而导致细胞停滞于G1期〔4〕。本实验说明何首乌饮可能通过促进cyclinD蛋白磷酸化阻断cyclinD/CDK4-CDK6-/Rb/E2F途径对Rb蛋白的磷酸化，促进细胞增殖，延缓衰老，其中以预防中剂量组效果最好。

1 孙 洁，李 晶，欧 芹，等.菟丝子醇提液对衰老模型大鼠肝细胞p16和cyclinD1基因表达的影响〔J〕．中国老年学杂志，2011;31(21):4208-10.

2 温进坤，韩 梅.医学分子生物学(理论与研究技术)〔M〕．北京:科学出版社，2010:357-73.

3 Shan NG，Trivedi TI，Tankshali RA，et al．Stat3 expression in oral squamous cell carcinoma:association with clinicopathological parameters and survival〔J〕．Int J Biol Markers，2006;21(1):175-83.

4 Dulic V，Drullinger LF，Lees E，et al．Altered regulation of G1 cyclins in senescent human diploid fibroblasts:accumulation of inactive cyclin ECdk2 and cyclin D1-Cdk2 complexes〔J〕．Proc Natl Acad Sci USA，1993;90(23):11034-8.

5 Stein GH，Dulic V.Origins of G1 arrest in senescent human fibroblasts〔J〕．Bioessay，1995;17(6):537-43.