人参皂苷Rg1对帕金森病小鼠黑质EphB1、ephrinB2表达的影响

朱丰霞 王淑秀 段 瑛 李培艳 张哲莹

(新乡医学院病理教研室，河南 新乡 453003)

帕金森病(PD)是一种常见的神经退行性疾病，其病理学特征是中脑黑质致密区(SNc)多巴胺能神经元变性及进行性缺失〔1〕。促红细胞生成素产生肝细胞受体(Eph)激酶是细胞表面型受体酪氨酸激酶(RTKs)的一种，其配体主要表达于细胞表面，被命名为ephrin。Eph/ephrin酪氨酸激酶家族可能参与调节PD多巴胺能神经元的变性过程〔2〕。人参皂苷Rg1属人参皂苷三醇型，具有保护大鼠大脑皮质神经元、防止细胞凋亡发生的功能〔3〕，对MPP+和氨基酸兴奋性毒性对多巴胺能神经元的损伤亦有保护作用〔4〕。人参皂苷Rg1可能通过调控细胞凋亡改善和治疗PD〔5〕。本研究观察人参皂苷Rg1对PD小鼠模型黑质多巴胺能神经元中EphB1、ephrinB2表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 12周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠27只，体重22～30 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司〔许可证编号SCXK(京)2006-0009〕。自然光照，实验前适应性喂养1 w。

1.2 试剂 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)购于Sigma公司;人参皂苷Rg1购于北京寰宇科技生物科技发展有限公司;RT-PCR试剂盒购于TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司;SP免疫组化染色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)购于碧云天生物技术有限公司;TRizol(Cat.No.1559 6-026)为美国Invitrogen公司产品;酪氨酸羟化物(TH)和β-actin小鼠抗小鼠单克隆抗体为美国Millipore公司产品;EphB1兔抗小鼠多克隆抗体(H-80)、ephrinB2兔抗小鼠多克隆抗体(H-83)为美国Santa Cruz公司产品;PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成;其余试剂均为国产分析纯。

1.3 动物分组与模型构建 将27只小鼠随机分为对照组、模型组和人参皂苷Rg1组，每组9只。注射MPTP前，对照组和模型组腹腔注射0.9%生理盐水(1 ml·kg-1·d-1)，人参皂苷Rg1组腹腔注射人参皂苷Rg1(10 mg·kg-1·d-1)，连续3 d。预防给药3 d后，对照组继续腹腔注射0.9%生理盐水(1 ml/kg)，模型组和人参皂苷 Rg1组腹腔注射 MPTP(20 mg/kg)，均注射4次，每次间隔2 h。在最后1次注射MPTP后第14天按不同实验要求取材。

1.4 游泳实验 分别于注射完MPTP后第1、5、9、13天将小鼠放入一个40 cm×25 cm×16 cm、水温(27±2)℃的水箱中，观察其游泳情况。小鼠游泳评分标准如下:后肢下沉头漂浮者计0分;偶尔用后肢游动并漂浮一边者计10分;偶尔游泳者计15分;漂浮时间占整个受试时间一半者计20分;大部分时间游泳仅偶尔漂浮者计25分;连续不停游泳者计30分〔6〕。

1.5 免疫组化染色 小鼠经6%水合氯醛麻醉(30 mg/kg)，4%多聚甲醛常规灌注固定脑组织后，迅速开颅取脑，4%多聚甲醛4℃后固定过夜，置于20%蔗糖沉底后，转入30%蔗糖至沉底，对包含黑质的脑组织进行冠状冰冻连续切片，采用SP免疫组化方法染色。染色方法按照试剂说明书进行。阴性对照以PBS代替一抗进行，余操作相同。每张切片随机选取黑质区的5个高倍视野，计数阳性细胞，取其平均值。

1.6 RT-PCR 应用TRizol试剂提取组织中总RNA。根据试剂盒说明书进行逆转录。PCR反应循环参数为:94℃ 2 min，94℃ 30 s，55 ℃30 s，72℃ 1 min，共 30 个循环，最后 72℃延伸5 min。GAPDH引物序列:正链为 5＇-GCCAAGGTCATCCATGACAAC-3＇，负链为 5＇-AGTGTAGCCCAAGATGCC CTT-3＇，PCR 扩增产物长度为351 bp;EphB1引物序列:正链为5＇-CTGGCTATTACCGAGCTGACTT-3 ＇，负 链 为 5 ＇-CCCATAGGCTACTGATGGAGAC-3＇，PCR扩增产物长度为279 bp;ephrinB2引物序列:正链为 5＇-GTGCCAGACAAGAGCCATGAA-3＇，负链为 5＇-GGTGCTAGAACCTGGATTTGG-3＇，PCR 扩增产物长度为 169 bp。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯(310 nm波长)下观察凝胶，采用快速凝胶成像系统拍摄电泳图谱条带，运用Geentools分析软件对条带进行分析，以目的基因与GAPDH的积分光密度比值表示目的基因mRNA表达水平。实验重复3次。

1.7 Western印迹法 每100 mg组织中加入1 ml细胞裂解液与PMSF的混合液(100∶1)冰浴30 min;超声1 s，间隔5 s，连续5次;4℃，12 000 r/min离心，17 min后取上清，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。蛋白定量后加1/4蛋白体积的5×SDS凝胶加样缓冲液混匀，沸水浴5 min，使蛋白变性，冰上冷却。以12%SDS-PAGE电泳分离，半干电转移法转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉4℃冰箱封闭过夜后加入一抗(EphB1多克隆抗体，1∶150;ephrinB2 多克隆抗体，1∶150;β-actin单克隆抗体，1∶4 000)，4℃过夜。TBST冲洗后，分别与生物素标记的山羊抗兔/小鼠IgG抗血清(1∶200)室温震荡孵育2 h。TBST洗涤后，化学发光法显色，X线底片曝光。用HP扫描仪扫描实验的底片，用Image J图像程序分析软件分析免疫印迹蛋白条带的积分光密度值，以目的基因与β-actin的积分光密度值之比值代表目的基因蛋白表达。实验重复3次。

1.8 统计学分析 计量数据以x±s表示，采用 SPSS16.0软件进行单因素方差分析及LSD检验。

2 结果

2.1 游泳实验 与对照组相比，模型组小鼠游泳时肢体协调性较差，大多数小鼠在水中漂浮时间较长;人参皂苷Rg1组小鼠游泳情况较模型组有所改善，仅偶尔在水中漂浮。见表1。

2.2 免疫组化 对照组黑质致密部可见大量TH阳性表达神经元，排列整齐呈条带状;与对照组相比，模型组TH阳性表达细胞明显减少，排列相对混乱;人参皂苷Rg1组，TH阳性神经元数目较模型组增多。模型组小鼠黑质TH阳性细胞数(9.93±4.35)显著低于对照组(20.80±7.08，P＜0.01)和人参皂苷 Rg1 组(13.27±7.11，P＜0.05)。

2.3 RT-PCR 模型组小鼠中脑黑质EphB1 mRNA表达水平(0.71±0.01)显著高于对照组(0.46±0.01，P＜0.01)和人参皂苷Rg1组(0.63±0.01，P＜0.01);模型组小鼠中脑黑质ephrinB2 mRNA表达水平(0.50±0.06)显著高于对照组(0.16±0.02，P＜0.01)和人参皂苷 Rg1 组(0.34±0.05，P＜0.01)，见图1，图2。

表1 小鼠游泳实验分值变化(x±s，n=9)

图1 RT-PCR检测小鼠黑质EphB1 mRNA表达的变化

2.4 Western印迹法 模型组小鼠黑质ephrinB2蛋白表达水平(0.40±0.02)显著高于对照组(0.14±0.01，P＜0.01)和人参皂苷 Rg1 组(0.18±0.13，P＜0.01)，各组差异显著(F=371.07，P＜0.01);模型组、对照组及人参皂苷Rg1组小鼠黑质EphB1蛋白水平分别为 0.40±0.03、0.37±0.01、0.36±0.05，各组间EphB1蛋白表达水平无显著差异。

图2 RT-PCR检测小鼠黑质ephrinB2 mRNA表达的变化

3 讨论

PD在65岁以上人群中发病率高达1%，其主要病变是黑质多巴胺能神经元显著变性丢失，黑质-纹状体多巴胺能通路变性，纹状体多巴胺递质浓度显著降低，乙酰胆碱系统功能相对亢进，导致运动减少、肌肉僵直、静止性震颤等临床表现〔7〕。

TH在多巴胺能神经元中含量丰富，是脑内多巴胺能神经元的蛋白标志，由于黑质区其他神经元缺乏TH，故黑质区TH免疫反应阳性神经元即多巴胺能神经元。在PD患者脑组织中，TH表达含量明显下降，表明多巴胺能神经元数量减少，因而黑质中TH阳性表达的神经元数量减少已成为PD动物模型建立成功的指标之一〔8〕。MPTP能显著降低黑质中TH的表达水平〔8〕。本研究结果提示MPTP诱导了黑质多巴胺能神经元变性，而人参皂苷Rg1可能保护多巴胺能神经元免受MPTP的毒性作用或防止多巴胺能神经元凋亡。游泳实验显示模型组小鼠四肢协调性比对照组和人参皂苷Rg1组差，可能与MPTP致多巴胺能神经元变性坏死或凋亡有关〔9〕，提示人参皂苷Rg1对神经元有一定的保护作用。

Eph受体酪氨酸激酶是一类具有酪氨酸激酶活性，参与细胞生理和病理过程的受体样物质。Eph受体及其配体ephrinB2在神经系统发育中参与组织边界形成、细胞迁移、轴突向导、突触信息和神经环路集合〔10〕。EphB在正常成年大鼠神经系统中低表达〔11〕，当神经损伤后其表达上调〔12〕，激活星形胶质细胞和少突胶质细胞，EphB在这些细胞上重新分布〔13〕。本研究发现EphB1和ephrinB2在正常小鼠和PD小鼠黑质中均有不同程度的表达，PD模型中EphB1和ephrinB2的 mRNA及 ephrinB2的蛋白表达水平均明显高于对照组，可能由于大剂量注射MPTP后导致小鼠黑质大量的多巴胺能神经元变性坏死，局部小胶质细胞和星形胶质细胞反应性增生，且EphB1和ephrinB2在这些细胞中重新分布呈高表达有关〔13〕，而EphB1蛋白在各组的表达无显著性差异，可能由于刺激因子尚未影响其翻译过程。人参皂苷Rg1干预后EphB1、ephrinB2的表达较模型组明显减少，可能与人参皂苷Rg1具有抗炎作用〔14〕，抑制小胶质细胞的增生有关。

综上所述，本研究认为人参皂苷Rg1可能通过降低EphB1、ephrinB2的表达改善PD症状，其具体机制尚需进一步研究。

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