荧光定量RT-PCR检测新疆变应性鼻炎患者外周血T细胞IL-2及MEF2 m RNA的表达水平

赵秀，高丽，张海蓉，姜孝芳(新疆医科大学，乌鲁木齐830011)

荧光定量RT-PCR检测新疆变应性鼻炎患者外周血T细胞IL-2及MEF2 m RNA的表达水平

赵秀，高丽，张海蓉，姜孝芳
(新疆医科大学，乌鲁木齐830011)

目的探讨新疆变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)患者外周血CD4+T淋巴细胞中IL-2及MEF2mRNA的表达水平，比较其表达的差异性。方法应用实时荧光定量RT-PCR技术检测53例变应性鼻炎患者和39例健康对照者外周血CD4+T淋巴细胞中IL-2及MEF2 mRNA的表达水平。结果2-△△Ct方法分析结果显示变应性鼻炎组患者的IL-2mRNA表达水平为(10.45±2.39)，高于健康对照组(8.67±2.27)，其差异具有统计学意义(P＜0.05)。变应性鼻炎组患者的MEF2mRNA的表达水平为(3.83±2.23)，健康对照组为(3.57±1.08)，其差异无统计学意义(P＞0.05)。维吾尔、汉变应性鼻炎患者的IL-2 mRNA和MEF2 mRNA基因表达无明显差异(P＞0.05)。结论变应性鼻炎组基因IL-2mRNA表达水平高于健康对照组，而MEF2mRNA基因表达在两组之间无明显差异。维吾尔、汉变应性鼻炎患者的IL-2mRNA和MEF2 mRNA基因表达无明显差异(P＞0.05)。

变应性鼻炎;IL-2mRNA;MEF2mRNA;RT-PCR

变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是一种常见病及多发病，是一个全球性健康问题，目前全球有20%～30%的人群患有AR，而且患病率仍在不断上升［1］。AR是机体接触变应原后主要由IgE介导的鼻黏膜非感染性炎性疾病［2］。

我国11个城市多中心成人AR自报患病率为10%～20%［3］，其中患病率最低的地区为北京(8.7%)，患病率最高的地区为乌鲁木齐(24.1%)。有研究显示AR的发病受环境的因素影响［4］。安扬等［5］在对新疆过敏性鼻炎的流行病学调查中发现汉族的发病率(33.36%)明显高于维吾尔族(19.19%)。研究显示IL-2 mRNA的分化不均可引起Th1/Th2细胞分泌失衡从而引起变应性鼻炎的发生，其在变应性鼻炎患者及健康人群外周血中的表达水平具有差异性。而对于MEF2 mRNA的研究较少，MEF2 mRNA表达异常可引起T细胞异常分化，可能会引起变应性鼻炎的发生，但目前没有直接证据证明其表达差异与变应性鼻炎有关。本研究应用实时荧光定量RT-PCR技术检测变应性鼻炎患者和正常对照者外周血CD4+T淋巴细胞中IL-2、MEF2 mRNA的表达水平，旨在探讨2种基因在变应性鼻炎患者与健康者及不同民族变应性鼻炎患者之间的差异，进而分析其在变应性鼻炎发病中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象选择2012年12月-2013年11月在新疆医科大学第一附属医院及新疆维吾尔自治区人民医院呼吸科门诊及病房的变应性鼻炎发作期患者53例为变应性鼻炎组，平均年龄(23.47±3.80)岁，其中维吾尔族27例，汉族26例，均在当地居住5 a以上者，并排除COPD、过敏性皮炎、高血压、糖尿病、孕妇及＞60岁老年患者。选取新疆医科大学健康志愿者39例为健康对照组，年龄(21.43±2.45)岁，既往无哮喘病史、过敏性疾病史及心血管疾病史，体检均正常者。所有受试者均在征求知情同意后接受试验。

1.2 标本采集及分离CD4+T淋巴细胞变应性鼻炎组及健康对照组均采集5 mL外周血，EDTA抗凝，采用免疫磁珠吸附法分离所需的CD4+T细胞。细胞分离出后将细胞移入冻存管中，将冻存管用封口膜封好放入液氮中冻存。

1.3 RNA抽提用Trizol法抽提细胞总RNA，具体操作严格按照试剂盒说明进行。

1.4 cDNA合成具体操作按逆转录试剂盒说明书进行，将逆转录好的cDNA放入-20℃冰箱冻存。1.5实时荧光定量RT-PCR检测IL-2、MEF2、GAPDH引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，SYBR Green荧光定量PCR试剂盒由Life Technologies公司提供。PCR反应体系为20μL:SYBR Green master 10μL，ddH2O 6μL，cDNA 2μL，上、下游引物各1μL。PCR扩增条件为95℃5 min总变性，95℃10 s，59℃30 s，进行45个循环。结果计算:通过相对定量以2-△△Ct表示样本中目的基因相对表达量。

1.6 统计学处理采用SPSS17.0统计软件对结果进行统计学分析，应用两独立样本均数t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 内参基因GAPDH及IL-2、MEF2基因的标准曲线以同一标本在不同管内做IL-2、MEF2基因的标准曲线，其扩增效率保持在85%～105%，符合进一步试验要求。

2.2 内参基因GAPDH及IL-2、MEF2基因的扩增曲线和溶解曲线熔解曲线为单一的主峰，说明产物为特异性扩增，见图1～6。

2.3 IL-2、MEF2 m RNA定量结果

2.3.1 变应性鼻炎组与健康对照组IL-2、MEF2 mRNA表达比较变应性鼻炎组IL-2 mRNA基因表达水平高于健康对照组，其表达差异具有统计学意义(P＜0.05);两组MEF2mRNA基因表达水平差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

图1 GAPDH基因扩增曲线

图2 GAPDH基因熔解曲线

图3 MEF2m RNA扩增曲线

图4 MEF2 m RNA熔解曲线

图5 IL-2m RNA扩增曲线

图6 IL-2m RNA熔解曲线

表1 变应性鼻炎组和健康对照组IL-2和MEF2基因m RNA表达水平(x s)

表1 变应性鼻炎组和健康对照组IL-2和MEF2基因m RNA表达水平(x s)

组别IL-2 MEF2变应性鼻炎组(n=53)10.45±2.39 3.83±2.23健康对照组(n=39)8.67±2.27 3.57±1.08 t值3.593 0.696 P值0.001 0.488

2.3.2 维吾尔、汉族变应性鼻炎患者IL-2和MEF2基因mRNA表达水平比较维吾尔、汉族变应性鼻炎患者IL-2mRNA基因表达差异无统计学意义(P＞0.05);维吾尔、汉族患者MEF2 mRNA基因表达差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

表2 变应性鼻炎组中维吾尔族与汉族患者IL-2和MEF2基因m RNA表达水平(s)

表2 变应性鼻炎组中维吾尔族与汉族患者IL-2和MEF2基因m RNA表达水平(s)

族别IL-2 MEF2维吾尔族(n=27)10.42±1.54 3.97±1.44汉族(n=26)10.48±3.07 3.69±2.85 t值-0.094 0.462 P值0.925 0.646

2.3.3 汉族变应性鼻炎患者与健康对照者IL-2mRNA基因表达比较汉族变应性鼻炎患者IL-2 mRNA基因表达水平高于健康对照者，其差异具有统计学意义(P＜0.05);汉族患者与健康对照者MEF2 mRNA基因表达差异无统计学意义(P＞0.05)，见表3。

表3 汉族变应性鼻炎患者和健康对照者IL-2及MEF2基因m RNA水平(s)

表3 汉族变应性鼻炎患者和健康对照者IL-2及MEF2基因m RNA水平(s)

组别IL-2 MEF2汉族变应性鼻炎患者(n=25)10.48±3.07 3.68±2.85健康对照者(n=39)8.67±2.85 3.57±1.07 t值2.726 0.274 P值0.008 0.806

2.3.4 维吾尔族变应性鼻炎组与健康对照组的IL-2 mRNA及MEF2基因mRNA水平基因表达比较维吾尔族变应性鼻炎患者组的IL-2 mRNA基因表达水平高于健康对照组，其差异具有统计学意义(P＜0.05);而MEF2 mRNA基因表达水平在维吾尔族变应性鼻炎组与健康对照组之间无统计学差异(P＞0.05)，见表4。

表4 维吾尔族变应性鼻炎患者和健康对照者IL-2及MEF2基因m RNA水平(±s)

表4 维吾尔族变应性鼻炎患者和健康对照者IL-2及MEF2基因m RNA水平(±s)

组别IL-2 MEF2维吾尔族变应性鼻炎患者(n=27)10.42±1.54 3.97±1.44健康对照者(n=39)8.79±2.25 3.47±1.15 t值3.472 1.321 P值0.001 0.191

3 讨论

变应性鼻炎是新疆的高发病，是由IgE介导的变态反应性疾病。近年来的研究认为CD4+T细胞及其相关细胞因子在变应性鼻炎的发展中起着重要作用［6］。CD4+T分泌多种细胞因子，其中Th1、Th2细胞分泌不均衡可能导致变应性鼻炎的发生，IL-2主要由Th1细胞分泌，可促进细胞介导的免疫应答，IL-2可诱导T淋巴细胞的分裂和增生，在T细胞增殖过程中具有非常重要作用。在机体受外源性感染后，IL-2的产生能力及机体对IL-2的反应能力降低，同时表达高亲和性的IL-2R，产生免疫抑制物质，抑制T细胞功能，降低机体免疫功能［7-8］，从而引起炎性疾病的发生。IL-2还可以直接作用于B细胞，促进B细胞分化及抑制IgE分泌，还可能对B细胞有直接调节作用，并且促进体液免疫反应，使体内的巨噬细胞激活，而对变应性疾病产生影响。本研究结果证实在变应性鼻炎组与健康对照组外周血中的IL-2基因表达具有一定的差异，考虑该差异可能是影响变应性鼻炎发生的因素;而其在维吾尔族与汉族变应性鼻炎患者血中的表达并无差异，考虑该基因不是引起维吾尔、汉族变应性鼻炎发病率差异的影响因素。MEF2是肌细胞增强因子(myocyteenhancerfactor2，MEF2)，是一种最早发现与骨骼肌管中的特定的转录因子，是一种蛋白质，但其具有与DNA结合的活性，MEF2家族可分为MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D［9-10］。MEF2在多种肿瘤细胞中均有表达，在肝细胞癌、T细胞性白血病、T淋巴细胞瘤等肿瘤细胞中均能检测到MEF2的存在，其均有异常表达，提示MEF2 mRNA与这些肿瘤的发生具有一定的关系，可能影响肿瘤的发生［11］。在小鼠实验过程中发现，如果敲出小鼠细胞中的MEF2C，可以影响T细胞的形成，这种影响主要是通过阻断T细胞早期的分化发育产生作用，使小鼠中T细胞的异常发育，引起与T细胞相关的疾病［12］。MEF2基因可以调节细胞因子基因的表达，可调节T细胞的表达和分泌。因MEF2基因在心肌、平滑肌等细胞中广泛存在，可对肌细胞的分化发育产生影响，故考虑其对气道的平滑肌产生作用而影响变应性鼻炎的发生。但本研究结果证实变应性鼻炎患者血中的MEF2基因水平与正常对照组并无明显差异，故考虑MEF2的表达差异不会影响变应性鼻炎的发生。且维吾尔、汉族变应性鼻炎患者血中MEF2基因表达无明显差异，考虑该基因不是引起维吾尔、汉族变应性鼻炎发病率差异的主要原因。目前对于MEF2基因的研究较少，增加样本含量进行进一步试验可能会得到更确切的结果。

本研究应用荧光定量RT-PCR技术对总体变应性鼻炎组与健康对照组进行检测发现，变应性鼻炎组IL-2mRNA的基因水平高于健康对照组，其差异具有统计学意义(P＜0.05)，变应性鼻炎组与健康对照组MEF2 mRNA的基因水平无明显差异(P＞0.05)。维吾尔族与汉族变应性鼻炎患者IL-2、MEF2mRNA基因水平均无明显差异(P＞0.05)。提示IL-2基因对变应性鼻炎具有一定的作用，而MEF2基因可能对变应性鼻炎没有明显影响，其作用有必要进一步研究证实。由于本研究样本量较小，如果扩大样本量可能会得到更确切的线索。由于变应性鼻炎引起患者不适［13-14］，影响患者生活工作，所以解决变应性鼻炎的基因方面的研究仍需努力。本试验为变应性鼻炎今后的治疗方面提供了新的理论依据。

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Detection IL-2and MEF2 m RNA expression levels in allergic rhinitis patients' T cells of Xinjiang Uyghur and Han by real-timeRT-PCR

ZHAO Xiu，GAO Li，ZHANG Hairong，JIANG Xiaofang
(Xinjiang Medical University，Urumqi830011，China)

Objective To research the IL-2 and MEF2mRNA expression levels of Xinjiang allergic rhinitis(allergic rhinitis，AR)patients'peripheral blood CD4+T of lymphocytes，to compared the differences of the two genes between this two groups.Methods Application of real-time RT-PCR technique for detecting 53 caseswith allergic rhinitis and 39 patients with healthy controls CD4+T of peripheral blood lymphocytes in the IL-2 and MEF2 mRNA expression levels.Resu lts 2-△△Ctto analysis the results shows that the allergic rhinitis group's IL-2mRNA expression is(10.45±2.39)，higher than healthy control group(8.67±2.27)，the difference was statistically significant (P＜0.05).The allergic rhinitis group's MEF2 mRNA levels in is(3.83±2.23)，in the healthy control group is (3.57±1.08)，the difference has no statistically significant(P＞0.05).IL-2 mRNA and MEF2 mRNA levels in Han and Uygur groups has no statistically significant(P＞0.05).Conclusion Allergic rhinitis group's IL-2 mRNA gene expression levels higher than healthy control group;and MEF2mRNA gene expression has no significant differences between the allergic rhinitis group and the control group(P＞0.05).IL-2mRNA and MEF2mRNA levels in Han and Uygur groups has no statistically significant(P＞0.05).

allergic rhinitis;IL-2 mRNA;MEF2 mRNA;RT-PCR

R34

A

1009-5551(2015)06-0721-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2015.06.015

2015-03-12］

(本文编辑张巧莲)

新疆维吾尔自治区自然科学基金(2013211B55);国家自然科学基金(81260006)

赵秀(1988-)，女，在读硕士，研究方向:呼吸道变应性疾病。

姜孝芳，女，高级实验师，博士，研究方向:呼吸道变应性疾病发病机制，E-mail:xinjiangjxf@163.com。

通信作者:高丽，女，教授，主任医师，博士生导师，研究方向:呼吸道变应性疾病，E-mail:xjmugaoli@sina.com。