eNOS/NO途径在单侧输尿管梗阻小鼠肾间质微血管病变中的作用与机制

陈雁，牛潼，白海涛，杨晓晶，张燕林，羊钦裕

（1.厦门大学附属第一医院儿科，厦门 361003；2.吉林大学基础医学院，长春 130000 3.厦门大学附属第一医院肾内科，厦门 361003；4.四川绵阳中心医院儿科，四川绵阳 621099）

研究报告

eNOS/NO途径在单侧输尿管梗阻小鼠肾间质微血管病变中的作用与机制

陈雁1Δ，牛潼2Δ，白海涛1*，杨晓晶1，张燕林3，羊钦裕4

（1.厦门大学附属第一医院儿科，厦门 361003；2.吉林大学基础医学院，长春 130000 3.厦门大学附属第一医院肾内科，厦门 361003；4.四川绵阳中心医院儿科，四川绵阳 621099）

目的探讨内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）和一氧化氮（nitric oxide，NO）在单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）肾间质纤维化小鼠微血管病变中的作用及机制。方法

内皮型一氧化氮合酶；一氧化氮；肾小管周围微血管；内皮祖细胞；血管生长因子；小鼠

多种进展性肾病存在肾小管周围微血管（peritubular capillaries，PTC）病变，PTC病变是加剧肾间质纤维化的重要原因。内皮细胞损伤和修复功能减退是导致PTC网丢失减少的主要原因。内皮细胞损伤后的分泌失调是微血管病变发展和演变过程中的重要特征。NO主要由血管内皮细胞合成，eNOS是NO合成的限速酶，通过催化L-精氨酸合成NO发挥生物学功能，eNOS/NO途径参与内皮细胞功能调节和血管生成，在维持微血管密度中起重要作用。研究显示eNOS敲除小鼠可存在先天性的肾脏发育异常，eNOS缺陷可导致严重的肾损伤［1］，提示eNOS/NO在肾脏病的发生发展中扮演着重要角色。本研究通过观察单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral occlusion，UUO）小鼠肾组织eNOS、VEGFmRNA、血清NO表达变化，计数PTC密度，探讨eNOS/NO途径对肾间质纤维化微血管病变的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

6周龄SPF级雄性KM小鼠，体重37～40 g，来源于厦门大学实验动物中心［SCXK（闽）2013-0001］。无菌手术在厦门大学实验动物中心屏障环境动物实验室进行［SYXK（闽）2013-0006］，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。PE标记抗小鼠CD133与同型对照（PE-CD133：E028258及Isotype control：E028728）、Pacific Blue标记抗小鼠VEGFR-2与同型对照（Pacific Blue：E031625及Isotype control：E022113）购于美国eBioscience公司。免疫组化检测兔抗小鼠多克隆抗体CD34（BA0532，抗体购于武汉博士德生物有限公司。Trizol购于Invitrogen公司（Cat no15596-026）。SYBR® Premix Ex TaqTMII实时定量反转录试剂盒（RR420A）购于TaKaRa公司。Real-time PCR所有引物由TaKaRa公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Nucleotide sequences of the primers

1.2 动物分组及模型建立

64只SPF级雄性KM小鼠随机分为模型组（UUO组，n=32）和假手术组（sham组，n=32）。UUO组小鼠10%乙醚麻醉后经右侧耻骨上切口，行右侧输尿管游离结扎。Sham组仅游离右侧输尿管及右肾，不结扎，不切断。分别于实验第7、14、21、28天每组各随机抽取8只动物处死，处死当日眼球取血，其中约200μL滴入末梢血EDTA抗凝管备流式细胞检测，其余以干燥管取上层血清备NO、BUN、Cr检测。

1.3 血生化指标检测

硝酸还原酶法测定血清NO。

1.4 外周血内皮祖细胞流式细胞检测

（1）外周抗凝血50μL分置2个离心管，一管中加入5μL PE标记抗小鼠CD133及2.5μL Pacific-Blue标价抗小鼠VEGFR2，另一管加入等量同型对照，充分震荡后室温避光静置50 min。每份标本滴加红细胞裂解液200μL，避光20 min。4℃3000 r/min×3 min，吸取上清液后PBS洗涤3次后悬浮，调节细胞浓度至105个/mL。用Partec CyFlow Space流式细胞仪以其配套的Partec PASCell Quest软件进行流式细胞分析。检测由厦门大学医学院中心实验室协助完成。

1.5 肾脏病理形态学检测

常规制作2μm石蜡切片做Masson染色。

1.6 免疫组化检测CD34表达计数PTC密度

采用SP法，以PBS代替一抗做阴性对照染色，染色步骤按试剂盒说明。CD34染色计数PTC密度：一抗为兔抗小鼠多单隆抗体CD34（1：100），二抗为滴加生物素化兔抗山羊IgG，PTC计数［9］：任何1个棕黄色的内皮细胞或内皮细胞簇作为一条微血管，只要结构不相连，分支结构也作为一条血管计数（除外大血管）。每个标本盲法随机观察肾皮质区不含肾小球的10个高倍镜视野（×400，0.065 mm2），计数阳性的毛细血管腔个数，得出PTC密度（个/mm2）取平均值。

1.7 Real-time PCR测定

肾皮质VEGF、eNOSmRNA的表达量：肾皮质称重约100 mg，加入Trizol试剂1 mL匀浆，按Trizol试剂盒说明书提取总RNA，反转录为cDNA。按三步法 LightCycler® Real-time PCR扩增仪（型号G10120）进行实时定量PCR。PCR程序：预变性95℃ 30 s；扩增95℃5 s、60℃15 s、72℃15 s，45个循环；熔解曲线分析：95℃15 s，65℃60 s。定量PCR反应体系：SYBR® Premix Ex TaqTMII（2×）10.0μL，PCR forward primer（10μmol/L）0.8μL PCR reverse primer（10μmol/L）0.8μL，DNA模板2.0μL，dH2O 6.4μL，总体系20.0μL。

1.8 统计学方法

采用SPSS 15.0统计软件包进行数据统计学分析。计算数据以均数±标准差（±s）表示。组间计量资料比较用t检验，指标间相关性用Pearson相关分析，均为双侧检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组小鼠血清NO变化

UUO组造模后第一周血清NO开始下降，一周后各时间点与Sham组差异有统计学意义（见表2）。

2.2 两组小鼠流式细胞检测外周血单个核细胞CD133+/v FGFR+双阳性细胞结果

造模后UUO组CD133+/VEGFR+双阳性细胞持续降低，2、3、4周与Sham组差异有统计学意义，见图1、2及表3。

表2 两组小鼠血清NO比较（μmo/L，xˉ±s，n=8）Tab.2 Comparison of serum NO levels in themice

表3 两组小鼠CD133+/VEGFR2+双阳性细胞流式细胞检测结果（%，xˉ±s，n=8）Tab.3 Comparison of CD133+/VEGFR+endothelial progenitor cells in themice determined by flow cytometry

2.3 两组小鼠肾组织病理

Masson染色sham组肾组织形态正常，UUO组见肾小管扩张及少数蛋白管型，肾间质纤维化逐渐加重，肾小管间质蓝染物质明显增多，见图3。

2.4 两组小鼠免疫组化监测肾间质CD34表达及PTC计数

免疫组化染色棕黄色细胞作为CD34阳性细胞，正常内皮细胞胞膜着色。Sham组PTC密度丰富，分布均匀，形态大致规则。UUO组PTC病变呈局灶性分布，随造模时间延长，PTC密度逐渐降低，排列紊乱，见图4。计数PTC密度，UUO组明显降低，第2、3、4周与sham组差异有统计学意义，见表4。

2.5 两组小鼠肾组织eNOSmRNA、v FGF mRNA表达

UUO组eNOSmRNA、VEGF mRNA表达持续下降，2周起与Sham组差异有统计学意义（图5及表5）。

注：A：Sham组（1周）；B：Sham组（2周）；C：Sham组（3周）；D：Sham组（4周）。图2 Sham组小鼠各时间点流式细胞图Note.A：Sham group，1week；B：Sham group，2 weeks；C：Sham group，3 weeks；D：Sham group，4 weeks.Fig.2 CD133+/VEGFR+endothelial progenitor cells in peripheral blood mononuclear cells of the sham group at different times

注：A：Sham组；B：UUO组（1周）；C：UUO组（2周）；D：UUO组（3周）；E：UUO组（4周）。图3 两组小鼠肾脏病理（Masson，×200HPF）Note.A：Sham group；B：UUO group（1week）；C：UUO group（2 weeks）；D：UUO group（3 weeks）；E：UUO group（4weeks）.Fig.3 Morphological changes in the renal tissue under opticalmicroscope（Masson staining，×200HPF）

表4 UUO组及Sham组小鼠肾间质PTC计数（个/mm2，xˉ±s，n=8）Tab.4 Counting of peritubular capillaries in the UUO and sham groups.

注：A：Sham组；B：UUO组（1周）；C：UUO组（4周）。图4 两组小鼠肾间质CD34染色结果（免疫组化×100HPF）Note.A：Sham group；B：UUO group（1week）；C：UUO group（4 weeks）.Fig.4 The expression of CD34 of renal interstitium by immunohistochemical staining

表5 两组小鼠肾组织eNOSmRNA、VEGFmRNA表达（PI，xˉ±s n=8）Tab.5 The expression of eNOSmRNA and VEGFmRNA in renal tissue of themice.

注：A：GAPDH；B：eNOS；C：VEGF。图5 Real-time PCR扩增曲线Note.A：GAPDH；B：eNOS；C：VEGF.Fig.5 Amplification curves of the real-time-PCR analysis

2.6 Pearson相关分析显示

UUO小鼠血清一氧化氮水平与肾间质微血管密度呈正相关（r=0.715，P＜0.05）；eNOSmRNA表达水平与肾间质微血管密度（r=0.624，P＜0.05）、内皮祖细胞计数（r=0.375，P＜0.05）、VEGFmRNA（r=0.351，P＜0.05）呈正相关。

3 讨论

内皮细胞的损伤和再生修复功能减退是导致PTC丢失的主要原因。eNOS/NO与内皮细胞功能及血管生成密切相关，eNOS基因敲除小鼠可导致进展期局灶性肾损伤，且局部病变的严重程度与PTC密度呈正相关，维持eNOS表达，能减少PTC损伤，从而延缓RIF的病理进程［2］。本研究显示UUO组成模后eNOS、NO水平呈持续下降趋势，eNOS、NO与PTC密度存在显著直线正相关，提示eNOS/NO参与了肾间质纤维化微血管病变的发生发展。

eNOS/NO途径可能通过多种机制参与PTC的调节。慢性肾损伤进展过程中炎症因子、缺氧等因素损伤内皮细胞，NO等舒血管物质分泌减少，ET-1等缩血管物质释放增加，可进一步加剧内皮细胞的损伤，导致间质纤维化进展中微血管病变的恶性循环［3］。NO是目前所知最强的内皮源性舒血管因子之一，能维持正常内皮舒张抑制痉挛收缩，清除自由基，抑制脂质过氧化反应，保持PTC正常的形态学结构和功能。本研究显示UUO组NO表达持续下降，提示eNOS/NO对血管舒张功能的调节可能参与了PTC密度的维持。

eNOS/NO途径是血管生成必须的调节因子，参与调节内皮细胞的生长、凋亡、迁移以及干细胞动员、募集，在不同组织的血管生成过程中都起重要作用［4］。给予肢体缺血的家兔口服Lˉ精氨酸后缺血肢体血管生成明显增加，而eNOS基因缺失时缺血肢体的血管生成明显减弱［5］。慢性肾脏病变过程中eNOS/NO途径可能通过参与血管的生产而维持肾间质微血管密度。

VEGF是一个强有力的促血管生成因子，近年来的研究已经证实它在新生血管形成过程中居于中心地位［6，7］，血管再生能力的下降伴随eNOS和VEGF表达减少。本研究UUO组VEGF表达持续下降，相关分析显示与eNOSmRNA表达呈直线正相关。提示介导促血管生长因子的血管新生作用可能参与了，是eNOS/NO维持PTC可能机制。

外周血EPCs是血管内皮细胞的前体细胞，eNOS/NO参与干细胞的动员及分化，eNOS的基因缺陷将造成EPCs动员障碍而影响新生血管生成［8］。研究显示Ⅱ型糖尿病患者EPC血管生成能力下降伴eNOSmRNA、蛋白表达下调，NO分泌降低，补充外源性NO，血管生成的数量、复杂程度增加，提示糖尿病患者血管生成能力降低与NO合成减少有关［9］。在Verma等［10］的研究中发现，C反应蛋白（CRP）通过抑制eNOS的表达从而抑制EPC增殖及迁移能力，本研究UUO组外周血EPCs数量持续下降，与eNOS表达呈正相关，提示动员EPCs是 eNOS/NO途径调控微血管密度的机制之一［11］。

综上所述，eNOS/NO途径对微血管的调控作用可能对慢性肾损伤产生影响的机制之一，eNOS/NO对微血管的调控有多种机制参与，临床用药物调控eNOS/NO途径从而影响内皮细胞修复及血管再生过程，将可能产生肾脏保护作用。

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Role of eNOS/NO signaling pathway in peritubular capillary lesions in renal interstitial fibrosis and the related mechanism in mousemodels of unilateral ureteral obstruction

CHEN Yan1，NIU Tong2，BAIHai-tao1*，YANG Xiao-jing1，ZHANG Yan-lin3，YANG Qin-yu4
（1.Department of Pediatrics，2.College of Basic Medical Sciences，Jilin Univercity，Changchun 130000，China；3.Department of Nephrology，the First Affiliated Hospital，Xiamen University，Xiamen 361003；4.Department of Pediatrics，Mianyang Central Hospital，Mianyang 621099）

Ob jectiveTo investigate the role of eNOS/NO signaling pathway in peritubular capillary lesions of mouse renal interstitial fibrosiswith unilateral ureteral obstruction（UUC）and the potentialmechanism.M ethodsSixtyfour healthymale KM mice were randomly divided into sham operated group（n=32）and unilateral ureteral obstruction group（n=32）.At each week，serum BUN，Scr and NO were determined and the percentages of CD133+/VEGFR+endothelial progenitor cells in peripheral blood mononuclear cells were detected by flow cytometry.Morphological changes of the renal tissue were observed using Masson staining.The expression of CD34+cells in the renal interstitium was analyzed by immunohistochemistry to calculate the peritubular capillary density.The expressions of eNos and VEGFmRNA were determined by real-time PCR.ResultsThe expression of blood NO，the percentages of endothelial progenitor cells，peritu-bular capillaries，eNOSmRNA，and VEGFmRNA in the UUO group were significantly decreased compared with those of the sham group at2，3，and 4 weeks（P＜0.05）.NO was positively correlated with peritubular capillaries（r=0.715，P＜0.05），eNOSmRNA was positively correlated with peritubular capillaries（r=0.624，P＜0.05），endothelial progenitor cells（r=0.375，P＜0.05），and VEGFmRNA（r=0.351，P＜0.05）.ConclusionseNOS/NO signaling pathway participates in regulation of peritubular capillary lesions in renal interstitial fibrosis of UUOmice.Themechanism may be partly related to the regulation of vasomotor reflex，the expression of VEGFmRNA and mobilization of endothelial progenitor cells.

Endothelial nitric oxide synthase；Nitric oxide；Peritubular capillary；Endothelial progenitor cells；Angiogenesis growth factor；Mice

Q95-33

A

1005-4847（2015）05-0484-06

10.3969/j.issn.1005ˉ4847.2015.05.008

2015-04-24

福建省卫生厅青年科研课题（编号：2010-2-92）。

陈雁（1984ˉ），女，主治医师，硕士，专业：小儿肾脏病，Email：ccynthia0324@hotmail.com。Δ共同第一作者。

白海涛（1967ˉ），女，主任医师，博士，研究方向：干细胞与肾脏再生。Email：baihaitao@163.com

64只KM小鼠随机分为两组：假手术组n=32只；单侧输尿管梗阻UUO组n=32只。观察4周，每周检测各组小鼠血BUN、Scr及一氧化氮，流式细胞计数外周血CD133+/VEGFR+内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）、Masson染色观察肾组织形态学变化，免疫组化法检测肾间质CD34+表达计数微血管密度，实时定量PCR检测肾皮质eNOS、VEGFmRNA表达。结果UUO组血一氧化氮、内皮祖细胞计数、肾间质微血管密度、eNOS、VEGF mRNA表达水平持续下降，在第2、3、4周与对照组差异有统计学意义。一氧化氮水平与肾间质微血管密度呈正相关（r=0.715，P＜0.05）；eNOSmRNA表达水平与肾间质微血管密度（r=0.624，P＜0.05）、内皮祖细胞计数（r= 0.375，P＜0.05）、VEGFmRNA（r=0.351，P＜0.05）呈正相关。结论eNOS/NO途径参与了UUO小鼠肾间质微血管的调节，其调节涉及对血管舒张功能影响、介导促血管肾脏因子VEGFmRNA表达及动员内皮祖细胞等机制。