沼泽红假单胞菌对小鼠免疫功能影响的试验研究

耿亚亚，王妍力，李小旭，郝葆青

(西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041)

沼泽红假单胞菌对小鼠免疫功能影响的试验研究

耿亚亚，王妍力，李小旭，郝葆青

(西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041)

为探讨沼泽红假单胞菌对动物免疫功能的影响，采用不同菌液浓度的沼泽红假单胞菌饲喂小鼠，检测小鼠免疫器官(脾脏和胸腺)实质重量、巨噬细胞吞噬能力、外周血淋巴细胞转化率以及肠黏膜SIgA等指标，分析沼泽红假单胞菌对试验小鼠免疫功能的影响.结果显示，饲喂沼泽红假单胞菌可促进小鼠的体重增长，脾脏和胸腺的重量增加(P＜0.05);促进机体巨噬细胞吞噬率、淋巴细胞转化率以及肠黏膜SIgA的变化(P＜0.05).结论:采用沼泽红假单胞菌饲喂小鼠可提高其机体的免疫能力.

沼泽红假单胞菌;免疫器官;巨噬细胞吞噬率;淋巴细胞转化率;SIgA

沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)是应用最为广泛的一种光合细菌，也是一类最早被认定为饲料级添加剂的益生菌，其菌体营养丰富，蛋白质含量高达65%，是一种理想的饲料蛋白［1］.同时，沼泽红假单胞菌也含有种类丰富的生物活性物质，包括叶酸、辅酶Q、类胡萝卜素和大量B族维生素，它们可对动物肠道内繁殖的正常菌群起到促进或平衡的作用［2］.目前，有观点认为沼泽红假单胞菌适应性强，并产生一些抗菌物质抑制有害菌的生长，促进营养物质的消化吸收［3］.并且，有报道认为沼泽红假单胞菌富含的各种活性因子及微量元素(比如硒)，能提高机体的生产性能和抗病能力［4-5］.但是对于沼泽红假单胞菌促进免疫功能的研究报道较少.试验采用不同菌液浓度的沼泽红假单胞菌饲喂小鼠，检测小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力、淋巴细胞转化率、肠黏膜SIgA以及免疫相关器官重量变化的观察和检测，分析沼泽红假单胞菌对小鼠免疫功能的影响，为该光合菌制剂的进一步开发和应用提供依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

沼泽红假单胞菌原浓度的菌液(活菌数为6×109个/mL)实验室备用.恒河猴肾细胞系LLC-MK2，购自成都豪乙生物科技有限公司.

健康的4周龄雄性昆明小鼠(体重20.0±2.0 g)80只，购自成都达硕实验动物有限公司.

植物血凝素(phytohaemagglutinin，PHA);PBS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液);瑞氏染液;丙酮-甲醇固定液;瑞氏-姬姆萨混合染色液.

1.2 试验方法

1.2.1 沼泽红假单胞菌毒性试验

将LLC-MK2细胞接种到96孔细胞培养板上培养，2.5×105个/孔.培养24 h后，用0.01 mol/L的无菌磷酸缓冲液(PBS)洗涤数次，除去没有贴壁的细胞.然后将沼泽红假单胞菌的原浓度菌液用细胞生长液10倍系列梯度稀释至108，把不同浓度的稀释液加入上述96孔细胞培养板孔内，培养72 h.对照孔内仅加等量的生长培养液.采用MTT法测定各小孔的活细胞数，确定回归方程，计算出半数抑制细胞存活指数(IC50)(抑制细胞数目一半时所需的药物浓度).

1.2.2 沼泽红假单胞菌对小鼠体重及免疫器官重量的影响

经过3天适应性饲养，将80只小鼠随机分为四组(每组设两个重复对照)，各组分别每天灌胃蒸馏水(对照组)，原浓度菌液(试验组1)，2倍稀释菌液(试验组2)与4倍稀释菌液(试验组3)1 mL，饲喂期间小鼠自由采食(普通全价饲料)和饮水，隔日更换垫料，连续饲喂28天.各组小鼠每隔一日称重并记录.

1.2.3 沼泽红假单胞菌对小鼠巨噬细胞吞噬作用的影响

试验最后一次饲喂沼泽红假单胞菌后1h，每组小鼠腹腔注射0.5%的鸡红细胞悬液1 mL，轻柔小鼠腹部，分散鸡红细胞悬液.注射鸡红细胞30 min后，处死小鼠剖开腹腔，用注射器吸取腹腔液，滴加于洁净的载玻片上，在垫有湿纱布的托盘内于37℃孵育30 min，吹干，用丙酮-甲醇固定液(两者比例为1:1)固定5 min，然后用瑞氏染液染色，在显微镜下观察计数100个吞噬细胞，按文献公式［6］计算吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数和被吞噬的鸡红细胞数.试验结束后，解剖取出脾脏、胸腺，称重并记录.

1.2.4 沼泽红假单胞菌对小鼠淋巴细胞转化的影响

选试验组和对照组各10只小鼠，试验组仍采用沼泽红假单胞菌菌液连续饲喂8天，取饲喂3d、4d和6d分别进行三次植物血凝素PHA(5 mg/kg)的肌肉注射.饲喂8d时，小鼠尾尖采血，推血涂片，用瑞氏-姬姆萨混合染色液染色30 s～1 min，用PBS缓冲液冲洗血片，显微镜观察计数100个淋巴细胞、淋巴母细胞、过渡型淋巴细胞，参照文献［7］计算淋巴细胞转化率.

1.2.5 肠黏膜SIgA含量测定

将上述试验小鼠处死，取靠近回盲部的肠段1.5 cm，纵向剖开后用生理盐水反复冲洗肠腔表面，刮取黏膜表面黏液，放入EP管中，加入0.5 mL 0.01 mol/L的PBS溶液混匀，10000 r/min离心15 min，取上清液，保存于-20℃待检.采用伊莱瑞特生物公司试剂盒，然后用酶标仪检测.

1.2.6 数据统计

最后采用EXCEL对数据进行初步的处理，用spss 18.0进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，运用LSD法进行多重比较，结果数据均以平均值±标准差(±S)表示.

2 结果与讨论

2.1 沼泽红假单胞菌对LLC-MK2细胞无毒性

沼泽红假单胞菌菌液的细胞毒性试验结果显示，试验结果不能确定IC50(抑制细胞数目一半时所需的药物浓度)，即使原浓度菌液(活菌数为6×109个/mL)10倍稀释时，测试小孔的活细胞数也达到84%.试验组与对照组的活细胞数无显著差异(p＞0.05)，即沼泽红假单胞菌的菌液对LLC-MK2细胞不具有细胞毒性或毒性极低.因此，可推断该沼泽红假单胞菌菌液可用于动物饲喂，安全无副作用.

2.2 不同菌液浓度沼泽红假单胞菌对小鼠体重变化的影响

相比对照组，各试验组小鼠平均增重12.06±1.97 g，10.22 ±3.40 g，8.78 ±3.32 g，相对增重率分别达到137.82%、116.81%、100.34%(见表2-2).不同浓度的沼泽红假单胞菌菌液对小鼠的增重情况也不同，试验组1小鼠平均增重12.06 g，增重超过30%，高于其它试验组，与对照组相比差异显著(P＜0.05)，试验组之间差异不显著(P＞0.05).

以平均增重与相对增重率为纵坐标、组为横坐标可得到不同浓度的沼泽红假单胞菌对小鼠体重的影响图，见图1.由图1可看出，随着沼泽红假单胞菌浓度的上升，各组小鼠体重也随之上升且差异明显.高浓度的沼泽红假单胞菌菌液能有效增加体重，促进小鼠的生长.与对照组比较，表明该组小鼠健康状况良好.

表1 小鼠体重增值表Table 1 weight gain in mice

图1 不同浓度的沼泽红假单胞菌对小鼠体重的影响Fig.1 Effect of different concentrations of palustris on body weight of mice

2.3 沼泽红假单胞菌对小鼠免疫器官、淋巴细胞转化率的影响

不同浓度的沼泽红假单胞菌对脾脏和胸腺重量的影响程度也不同，试验组1与对照组相比差异显著(P＜0.05)，并且与其它试验组相比差异也显著(P＜0.05)，试验组2与对照组相比差异显著(P＜0.05)，与试验组3相比，差异不显著(P＞0.05)，试验组3和对照组之间差异不显著(P＞0.05)(如表2).表明所使用沼泽红假单胞菌能够促进小鼠免疫器官的发育，浓度越高的菌液对小鼠免疫器官发育的促进作用越显著.结果还表明，相比对照组，各试验组淋巴细胞转化率均有增加，试验组1与对照组相比，淋巴细胞转化率差异显著(P＜0.05)，但与试验组2相比，差异不显著(P＞0.05).其它试验组与对照组相比差异均显著(P＜0.05)(如表2).表明沼泽红假单胞菌作为益生菌有增强特异性细胞免疫的作用.

具有免疫功能的器官、组织、细胞和分子组成了机体的免疫系统［8］.淋巴细胞(Lymphocyte)是由淋巴器官产生的.它包括T细胞、B细胞和NK细胞等亚类，分别介导机体的细胞免疫、体液免疫，并对肿瘤细胞和病毒感染细胞等具有杀伤作用［9］.淋巴细胞是反映特异性细胞免疫能力的重要指标［10］.各试验组淋巴细胞转化率均有增加，表明沼泽红假单胞菌对特异性细胞免疫有增强作用.

表2 不同浓度的沼泽红假单胞菌对免疫器官、淋巴细胞转化率的影响(每组10只小鼠)Table 2 Effect of different concentrations of palustris on immune organs and lymphocyte transformation rate

2.4 对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响

与对照组相比，各试验组小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率及吞噬指数均有提高.试验组1与对照组小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率及吞噬指数相比差异显著(P＜0.05)，试验组2与对照组相比差异显著(P＜0.05)，但试验组3与对照组相比差异不显著(P＞0.05)(见表3)，表明沼泽红假单胞菌能显著提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力，促进小鼠非特异性免疫功能.一定条件下，菌液浓度越高，提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力的作用越强.

巨噬细胞既参与机体的特异性免疫，又在非特异性免疫过程中起着重要作用.巨噬细胞是机体防御功能的重要组成部分［11］.沼泽红假单胞菌能够增强巨噬细胞的吞噬能力.

表3 对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响Table 3 Effect of mouse peritoneal macrophages phagocytosis

2.5 小鼠肠黏膜SIgA含量测定结果

各试验组SIgA含量均高于对照组，各试验组的肠黏膜SIgA含量与对照组相比差异均显著(P＜0.05)，而且试验组之间的差异也显著(P＜0.05)(如表4).表明沼泽红假单胞菌可促进肠黏膜SIgA的合成.SIgA抗体可中和病毒，是构成肠道黏膜免疫的重要组成部分［12］.

表4 小鼠肠黏膜SIgA含量Table 4 Intestinal mucosal SIgA content

3 结论

沼泽红假单胞菌可以促进小鼠生长，促进小鼠免疫器官的发育，菌液浓度越高的沼泽红假单胞菌对小鼠免疫器官发育的促进作用越显著.沼泽红假单胞菌可促进免疫器官的发育，有助于动物的生长，也可增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力、淋巴细胞转化率、SIgA的含量，从而增强小鼠的抗病能力.

本试验结果表明，沼泽红假单胞菌可以促进或增强机体的特异性和非特异性免疫功能.

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Effect of Rhodopseudomonas Palustris on the immune function of mice

GENG Ya-ya，WANG Yan-li，LI Xiao-xu，HAO Bao-qing
(School of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.)

To investigate the influence ofRhodopseudomonas Palustrison the immune function of animals，the experimental mice were fed onRhodopseudomonas Palustriswith different concentrations.The immune organ(spleen and thymus)changes in weight，the phagocytic ability of macrophages，the conversion rate of peripheral blood lymphocytes and SIgA in the intestinal mucosa were detected in order to test the effect ofRhodopseudomonas Palustrison immune function in mice.The results showed that the mice fed onRhodopseudomonas Palustriscould significantly promote their weight gain，spleen and thymus weights(P ＜0.05)，and promote the body＇s macrophage phagocytosis rate，lymphocyte transformation rate and the content of intestinal mucosa SIgA(P＜0.05).The conclusion indicates the immune function of the mice fed by theRhodopseudomonas Palustriswas increased.

Rhodopseudomonas palustris;immune organ;macrophage phagocytosis rate;lymphocyte transformation rate;SIgA

Q939.9

A

2095-4271(2015)06-0678-04

10.11920/xnmdzk.2015.06.004

2015-07-20

郝葆青(1956－)，男，满族，四川成都人，教授，博士.E-mail:1296714389@qq.com

西南民族大学研究生“创新型科研项目”(CX2014SZ89)

(责任编辑:李建忠，付强，张阳，罗敏;英文编辑:周序林，郑玉才)