生脉饮、失笑散对阿霉素心脏毒性心衰模型大鼠脂质过氧化影响的对比研究

杨丽祥彭 哲

生脉饮、失笑散对阿霉素心脏毒性心衰模型大鼠脂质过氧化影响的对比研究

杨丽祥1彭 哲2

目的 观察生脉饮、失笑散对阿霉素心脏毒性心衰模型大鼠脂质过氧化的影响。方法 SD大鼠108只分为正常组、模型组、曲美他嗪组、生脉饮高剂量组、生脉饮低剂量组、失笑散组，每组18只。阿霉素腹腔注射制备心脏毒性心衰模型，各药物组予相应药物灌胃（曲美他嗪组、生脉饮低剂量组、失笑散组均为临床等效剂量，生脉饮高剂量组为临床等效剂量4倍），1天1次；正常组予等量生理盐水。灌胃14天后及28天后分别采集标本。酶联免疫法检测血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）。结果 ①灌胃28天，模型组SOD（1.992±0.245）ng/mL，与其余各组比较明显下降（P＜0.05）；生脉饮低剂量组SOD（4.142±0.362）ng/mL高于失笑散组的（3.643±0.366）ng/mL（P＜0.05）；生脉饮高剂量组SOD（5.475±0.155）ng/mL，高于低剂量组（P＜0.05）；②灌胃28天，模型组MDA（4.345±0.170）nmol/mL，与其余各组比较明显升高（P＜0.05）；生脉饮低剂量组与失笑散组比较无明显差异（P＞0.05）；生脉饮高剂量组MDA（2.929±0.206）nmol/mL，低于低剂量组的（3.122±0.144）nmol/mL（P＜0.05）；③各药物组灌胃28天均较灌胃14天SOD提高、MDA明显降低（P＜0.05）。结论

大鼠；心衰模型；生脉饮；失笑散；脂质过氧化；SOD；MDA

诸多证据表明，心脏的能量代谢障碍是心肌细胞发生损伤的始动环节，也是引发心功能恶化的重要因素。van Bilsen等[1]提出“代谢重构”的概念，即由于心肌细胞糖类和脂肪等物质代谢紊乱，引起能量代谢途径发生改变从而致心脏结构和功能异常。目前优化心肌能量代谢障碍多从氧化应激损伤、继发线粒体损伤、钙超载、脂质过氧化物酶体增殖激活受体及细胞凋亡等方面研究。本实验研究中医经典方剂对抗氧化应激损伤的作用机理。

1 实验材料

1.1 动 物 健康雄性SD大鼠108只，SPF级，体质量（200±20）g，由浙江中医药大学动物实验中心提供及饲养，生产许可证号：SCXK（沪）2008-0016。将大鼠分为6只/笼，实验期间均给予标准饲料及自由饮水。

1.2 药 物 生脉饮组方：人参10g，麦冬15g，五味子6g；失笑散组方：炒蒲黄、五灵脂各15g。各组方加水煎煮2次，第1次1.5h，第2次0.5h，2次药液混合后浓缩成1g/mL的生药煎剂。中药由杭州市中医院制剂室提供。曲美他嗪片（规格20mg/片，批号20100324，施维雅制药有限公司）。注射用盐酸多柔比星粉针剂（规格10mg/瓶，批号20110118，浙江海正药业有限公司）

1.3 试剂与仪器 大鼠超氧化物歧化酶（SOD）酶联免疫检测试剂盒（R&D公司，批号RT201104302），大鼠丙二醛（MDA）酶联免疫检测试剂盒（R&D公司，批号RT201202227）；4℃冷冻高速离心机；超低温冰箱；-20℃低温冰箱；Thermo labsystems公司移液枪；Thermo公司酶标仪；FA1104电子天平；自动三蒸纯水蒸馏器。

2 实验方法

2.1 分组及给药 108只SD清洁级大鼠随机分为正常组、模型组、曲美他嗪组、生脉饮高剂量组、生脉饮低剂量组、失笑散组，每组18只。给药剂量根据成人与大鼠等效剂量换算公式计算[2]，曲美他嗪组以临床等效剂量为用药量即：7.0g/（kg·d）；生脉饮低剂量组、失笑散组均予成人等效剂量即：3.6g/（kg·d）、3.5g/（kg·d）；生脉饮高剂量组为临床等效剂量给药量的4倍即：14.4g/（kg·d）。

公式：大鼠用量（g/kg/d）=成人临床有效剂量（g/ d）/体质量（kg）×换算标准（7）。注：成人平均体质量按60kg计算。

2.2 模型建立 参照阿霉素慢性心衰模型造模方法[2]并加以改进。动物饲养1周，将阿霉素用注射用水溶解，配制成2mg/mL溶液，按照2.5mg/kg给药，每周1次，共6周，累积量达15mg/kg；正常组每日腹腔注射等量生理盐水，时程同模型建立方法。模型建立成功后，各药物组予相应药物灌胃1天1次；正常组灌胃予等量0.9%生理盐水。灌胃14天后，各组处死一半数量大鼠取材，剩余大鼠继续给药，28天后将剩余大鼠取材检测。

2.3 标本采集和制备 灌胃14天后，末次灌胃禁食不禁水12h，各组随机处死6只大鼠，采用腹主动脉取血方式抽取3.0mL，将血液置于Eppendorf管中，分离血清（4000r/min，4℃，离心15min），吸取血清存于-20℃冰箱备用；余下各组大鼠继续灌胃治疗，给足28天后标本留取方法同上。

2.4 指标检测 按照SOD与MDA试剂盒操作说明书进行测定，用分光光度计于波长450nm测量各孔的吸光度（OD值）空白孔调零，运用CurveExpert 1.4分析软件，根据标准品浓度及对应的OD值计算标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。

3 实验结果

3.1 大鼠死亡率统计 正常组大鼠一般状态正常，体质量呈良性增长，存活率100%。模型组第4周死亡2只，至实验结束共死亡6只，死亡率为33.3%；曲美他嗪组第4周死亡1只，实验结束时共死亡4只，死亡率为22.2%。生脉饮高剂量组第5周死亡2只，至实验结束共死亡4只，死亡率为22.2%；生脉饮低剂量组实验结束共死亡5只，死亡率27.8%；失笑散组实验结束死亡5只，死亡率为27.8%。

3.2 药物干预对大鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）的影响 各组灌胃14天、28天，与正常组比较，SOD水平均明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，各药物干预组SOD水平明显升高（P＜0.05），生脉饮高剂量组SOD升高优于低剂量组（P＜0.05），生脉饮低剂量组SOD升高优于失笑散组（P＜0.05）。灌胃14天，曲美他嗪组提升SOD水平作用优于中药干预组（P＜0.05）；灌胃28天，曲美他嗪组与生脉饮高剂量组SOD水平比较无明显差异（P＞0.05）。正常组灌胃28天与灌胃14天SOD水平比较，无明显差异（P＞0.05）；模型组SOD显著降低（P＜0.05）；各药物干预组灌胃28天SOD水平均优于灌胃14天（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血清超氧化物歧化酶比较（ng/mL，±s）

表1 各组大鼠血清超氧化物歧化酶比较（ng/mL，±s）

注：与正常组比较，★P＜0.05；与模型组比较，■P＜0.05；与曲美他嗪组比较，◆P＜0.05；与灌胃14天比较，*P＜0.05；与生脉饮低剂量组比较，○P＜0.05；与失笑散组比较，△P＜0.05

正常组模型组曲美他嗪组生脉饮高剂量组生脉饮低剂量组失笑散组6 6 6 6 6 6 6.313±0.791 2.421±0.403★5.167±0.489★■4.439±0.416★■◆○△3.748±0.380★■◆△3.081±0.329★■◆○6.766±0.579 1.992±0.245★* 5.871±0.294★■* 5.475±0.155★■*○△4.142±0.362★■◆*△3.643±0.366★■◆*○

3.3 药物干预对大鼠血清丙二醛（MDA）的影响

各组灌胃14天、28天，与正常组比较，MDA水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，各药物组MDA水平明显降低（P＜0.05）；曲美他嗪组MDA水平低于各中药组（P＜0.05）；生脉饮高剂量组降低MDA优于低剂量组（P＜0.05）；灌胃14天，生脉饮低剂量组优于失笑散组（P＜0.05）。灌胃28天与14天比较，正常组无明显差异（P＞0.05），模型组MDA水平升高（P＜0.05），各药物干预组均可明显降低MDA水平（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠血清丙二醛比较（nmol/mL，±s）

表2 各组大鼠血清丙二醛比较（nmol/mL，±s）

注：与正常组比较，★P＜0.05；与模型组比较，■P＜0.05；与曲美他嗪组比较，◆P＜0.05；与灌胃14天比较，*P＜0.05；与生脉饮低剂量组比较，○P＜0.05；与失笑散组比较，△P＜0.05

正常组模型组曲美他嗪组生脉饮高剂量组生脉饮低剂量组失笑散组6 6 6 6 6 6 1.957±0.088 4.034±0.216★2.982±0.098★■3.156±0.883★■◆○△3.300±0.078★■◆△3.476±0.068★■◆○1.944±0.072 4.345±0.170★* 2.719±0.137★■* 2.929±0.206★■◆*○△3.122±0.144★■◆* 3.278±0.113★■◆*

3 讨论

正常情况下[3]，细胞中存在抗氧化物如超氧化物歧化酶、过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶等，均有灭活并清除氧自由基作用，其中SOD是抗氧化防御体系中能有效清除氧自由基的金属酶类，其活性高低能反映机体清除氧自由基的能力。MDA是脂质过氧化反应终产物，其含量可间接反映细胞受氧自由基损害的严重程度[4]。因此，SOD与MDA的高低与阿霉素心脏毒性的脂质过氧化损伤程度有密切关联[5]。阿霉素心脏毒性所致心衰，可归属于中医“心悸”、“怔忡”、“喘证”等病证范畴，中医辨证认为其病机虚、瘀所致为多。慢性心衰患者多表现气短乏力，胸闷憋气，心悸怔忡，动则气喘，口干舌燥，自汗盗汗，口唇紫绀，舌黯红少苔，有瘀斑，脉细涩，或促、结、代等，为气阴两虚夹瘀之证。治以益气养阴、化瘀通络法，临床有较好的疗效。

本实验所选方剂生脉饮，由人参、麦冬、五味子组成，人参补肺气生津液为君；麦冬养阴清肺生津为臣；五味子敛肺止汗为佐。三药合用，共奏养阴生津、复脉固脱之功效。研究[6]表明，生脉饮可益气养阴，增强心肌收缩力，参与自由基代谢的调节，具有较强清除氧自由基抗氧化作用。张永全等[7]发现生脉注射液可提高患者血中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性，降低丙二醛（MDA）含量。曲绍春等[8]发现，人参Rb组皂苷（G-Rb）通过提高SOD及GSH-Px活性，降低血清脂质体（LPO）含量，说明其可增强抗氧化酶活性，还可以通过某种机制使脂质过氧化过程受到抑制。

失笑散源于《和剂局方》，由五灵脂、蒲黄二味配伍组成。研究[9]表明，五灵脂煎剂在体外测定有抑制超氧阴离子自由基的作用，体内实验表明具有激活体内SOD活力的作用。《本草纲目》谓：“蒲黄手足厥阴血分药也，故能治血止痛，生则能行，熟则能止，与五灵脂同用，能治一切心腹诸痛”。研究[10]显示，蒲黄可通过调节脂质代谢、抗脂质过氧化途径发挥抗动脉粥样硬化的作用，可显著降低MDA。陈亚鑫等[11]发现，加味失笑散可通过提高SOD的活性，保护抗氧化酶活力，抑制了氧自由基介导的心肌细胞膜损害，阻止细胞内外离子分布异常，稳定了心肌细胞内环境和心肌生理特性。

本研究中，大鼠连续注射阿霉素6周后，SOD水平显著降低，而MDA水平明显升高，提示阿霉素破坏了机体内促氧化物与抗氧化物的平衡，抗氧化酶水平的降低增加了大鼠心肌细胞氧化应激损伤，结果与文献报道相符合[12]。研究结果提示，生脉饮、失笑散均能通过提高心衰模型大鼠血清SOD活性、降低MDA含量，降低阿霉素心脏毒性心衰模型大鼠的脂质过氧化损伤。益气养阴的生脉饮作用优于活血化瘀的失笑散，生脉饮高剂量组优于生脉饮低剂量组（P＜0.05），存在一定的量效关系，且随给药时间延长作用更佳。该实验存在一定局限性，从模型考虑，本实验模型以心肌损害为主，而非冠脉结扎造成的心梗所致的心衰模型，因此显示活血化瘀的中药弱于益气养阴的中药。

［1］van Bilsen M，Smeets PJ，Gilde AJ，et al.Metabolic remodelling of the failing heart:the cardiac burn-out syndrome［J］.Cardiovase Res，2004，61（2）：218-260.

［2］李玉玲，杨建业，唐俊明，等.阿霉素诱导大鼠心衰模型不同方案的比较[J].中国比较医学杂志，2006，16（2）：95-96.

［3］王瑛主译.肿瘤化疗与生物治疗：原理与实践[M].北京:人民卫生出版社，2008，8：371.

［4］金凯，陈中军，罗华荣.盐酸阿霉素对大鼠心肌损伤的分子机制研究［J］.同济大学学报（医学版），2002，23（3）：191-194.

［5］Curtis D.Klaassen原著，黄吉武主译.毒理学：毒物的基础科学［M］.人民卫生出版社，2005，9：134.

［6］王玉秋，白令君，何锡文.复方生脉饮对羟自由基的清除作用研究［J］.中国中药杂志，1998，23（1）：45-47.

［7］张永全.生脉注射液对脑血栓急性期患者超氧化物歧化酶的影响［J］.中医药研究，1996，4：25-26.

［8］曲绍春，睢诚，于小风，等.人参Rb组皂苷对大鼠实验性心肌缺血再灌注损伤的保护作用［J］.吉林大学学报（医学版），2007，33（5）：849-852.

［9］陈月开，王海雄.五灵脂对小鼠血液中SOD活性的影响［J］.中国生化药物杂志，1994，15（3）：161-164.

［10］王利鲲，黄文权.蒲黄对高脂血症致动脉粥样硬化大鼠作用的实验研究［J］.中国中医急症，2009，18（5）：770-773.

［11］陈亚鑫，曹志然，唐志远.加味失笑散对家兔心肌缺血再灌注心律失常的防护作用［J］.医学研究与教育，2010，27（4）：21-23.

［12］徐淑云.药理实验方法学［M］.北京：人民卫生出版社，2003：1085-1086.

（收稿：2015-03-07 修回：2015-04-01）

Comparison of the Effect of Shengmaiyin and Shixiaosan on Lipid Peroxidation in Rats w ith Heart FailureInduced by Adriamycin

YANG Lixiang1,PENG Zhe2. 1 Department of Internal Medicine,TCM Hospital of Fuyang District,Hangzhou,Hangzhou(310000),China;2 Department of Cardiovascular Diseases,Guangxing Hospital Affiliated to Zhejiang Traditional Chinese Medical University,Hangzhou(310007),China

Objective To investigate the effect of Shengmaiyin and Shixiaosan on lipid peroxidation in adriamycin-inducing heart failure rat model.M ethods One hundred and eight SD rats were random ly divided into blank control group,model group,trimetazidine group,low-and high-dose of Shengmaiyin groups,and Shixiaosan group,with 18 rats in each group.Heart failure model of rats was induced by peritoneal injection of adriamycin. Every group was given the corresponding drug once per day（trimetazidine,low dose of Shengmaiyin,and Shixiaosan were therapeutic dose and high-dose of Shengmaiyin was 4 times of therapeutic dose）;blank control group was given equivalent volume of normal saline.On day 14 and 28 of treatment rats in each group were sacrificed for blood sampling.ELISA was used to detect serum superoxide dismutase（SOD）and malondialdehyde（MDA）.Results On day 28 of treatment,the serum SOD in model group（1.992±0.245ng/mL）was significantly lower than that in other groups（P＜0.05）;that in low-dose of Shengmaiyin group was higher than that in Shixiaosan group（4.142± 0.362ng/mL vs 3.643±0.366ng/mL,P＜0.05）;that in high-dose of Shengmaiyin group（5.475±0.155ng/mL）was higher than that in low dose group.On day 28 of treatment,the serum MDA in model group（4.345±0.170nmol/mL）was increased compared with that in other groups（P＜0.05）;no significant difference in that was found between lowdose of Shengmaiyin group and Shixiaosan group;but that in high-dose of Shengmaiyin group was lower than that in low dose group（2.929±0.206nmol/mL vs 3.122±0.144nmol/mL,P＜0.05）.The serum SOD was increased and MDAwas decreased on day 28 compared with those on day 14 in all groups（all P＜0.05）.Conclusion Both of Shengmaiyin and Shixiaosan treatment can reduce lipid peroxidation by elevating serum SOD and decreasing MDA in adriamycin-inducing heart failure rats.Shengmaiyin may have better efficacy than Shixiaosan does.

rats;heart failure model;Shengmaiyin;Shixiaosan;lipid peroxidation;SOD;MDA

杭州市卫生科技计划项目（No.2011A052）

1杭州市富阳区中医医院内科（杭州 310000）；2浙江中医药大学附属广兴医院心血管科（杭州 310007）

彭哲，Tel：13157173185

生脉饮、失笑散均能通过提高心衰模型大鼠血清SOD活性、降低MDA含量，降低阿霉素心脏毒性心衰模型大鼠的脂质过氧化损伤。生脉饮作用优于失笑散。