超声引导射频消融术对肝癌患者免疫功能的影响

闫景彬闫秀梅陈 斌孙洪伟

超声引导射频消融术对肝癌患者免疫功能的影响

闫景彬1闫秀梅2陈 斌3孙洪伟3

目的 观察射频消融术（RFA）对肝癌患者免疫功能的影响。方法 87例肝癌患者按治疗方法分为RFA组45例和手术组42例。应用流式细胞术检测两组治疗前后外周血CD3+T、CD4+T、CD8+T和CD56+NK细胞比例及CD4+/CD8+比值变化；通过细胞C3受体花环形成率（RBCC3BRR）、红细胞黏附肿瘤细胞花环率（RBC－TRR）和红细胞吸附免疫复合物花环形成率（RBC－ICR）实验检测外周血红细胞免疫功能；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清Th1型细胞因子（IL－2、IFN－γ、TNF－α）含量。结果 RFA组治疗15天CD3+、CD4+T细胞、CD4+/CD8+比值和NK细胞数目与治疗前比较显著升高（P均＜0.05）；治疗30天上述指标继续升高（P均＜0.05）；手术组治疗15天后CD3+、CD4+T细胞、CD4+/CD8+比值和NK细胞数目与治疗前比较升高不显著（P＞0.05），治疗30天后较治疗前显著升高（P均＜0.05）。治疗30天后，两组CD8+T细胞数目较治疗前均有所下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）。RFA组治疗15天RBC－ICR与治疗前比较显著下降（P＜0.05），RBC－C3bRR、RBC－TRR显著升高（P均＜0.05）；手术组治疗30天后上述指标才开始显著改善（P均＜0.05），但与同期RFA组比较差异有统计学意义（P均＜0.05）。RFA组治疗15天IL－2、IFN－γ、TNF－α浓度与治疗前比较显著升高（P均＜0.05），治疗30天后上述指标继续升高（P均＜0.05）；手术组治疗30天后IL－2、IFN－γ、TNF－α浓度与治疗前比较显著升高（P均＜0.05），但显著低于同期RFA组（P均＜0.05）。结论 与手术治疗相比较，RFA能更好地改善肝癌患者的淋巴细胞和红细胞免疫功能，促进Th1型细胞因子分泌，对肝癌治疗产生有益的影响。

肝癌；射频消融术；手术治疗；免疫功能；Th1型细胞因子

肝癌（hepatic carcinoma）是我国常见的恶性肿瘤之一，手术切除一直是临床首选治疗手段。但由于肝癌起病隐匿，多中心发生及早期播散、转移，使得外科手术切除率仅为20%～55%，术后复发率也较高，并发症偏多[1]。近20年来，超声引导射频消融术（radio frequency ablation，RFA）作为一种原位灭活肿瘤细胞的介入手段,在原发性、继发性肝癌的根治及姑息性治疗上得到广泛应用，具有安全有效、微创、耐受性好、并发症少等特点[2]。据报道，RFA除局部热凝治疗杀死肿瘤细胞，毁灭肿瘤组织外，还能改善患者的免疫功能[3－5]。本研究通过对肝癌患者RFA和手术治疗前后免疫功能、肝功能变化进行比较分析，探讨RFA在肝癌治疗方面的优势，为RFA的临床应用提供依据。

1 临床资料

选取本院肿瘤外科2012年2月—2013年4月经临床或肝穿刺活检病理证实的肝癌患者87例，男53例，女34例；年龄36～74岁，平均年龄（56.41± 6.73）岁；其中原发性肝细胞癌（HCC）61例，转移性肝癌26例。并且满足以下条件：①单个癌灶≤5cm，或多个癌灶（≤4个且每个≤3cm）；②肝癌患者未接受其他治疗；③无合并免疫系统疾患，半个月内无细菌、病毒感染史，且近半年未接受影响机体免疫功能的药物治疗；④门静脉或下腔静脉内无癌栓，亦无肝外转移；⑤肝功能Child－pugh分级为A或B级，血小板计数＞50×109/L，凝血酶原时间＜18s。

87例按治疗方法分为RFA组45例，手术组42例。两组患者平均年龄、性别、肝功能分级、AFP等级等比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，见表1。患者均自愿接受手术或RFA治疗，术前由本人或家属签字。治疗方法经医院伦理委员会批准，接受治疗后1个月内，患者不再接受化疗、放疗或免疫等其他治疗。

2 治疗方法

2.1 手术组 根据临床分期、患者肝功能情况，经术前准备、保肝治疗后，于全麻下采用肝叶切除或肝叶不规则切除术。切缘均达到癌灶旁1.5cm以上，确保无癌残留。

2.2 RFA组 采用日立公司EUB7500型彩色多普勒诊断仪，探头频率3.5～4.0MHz。美国达隆公司RF－2000射频治疗仪，发射频率500kHz，功率100W；取适当体位，以超声明确定位癌灶后，确定进针点。常规消毒铺巾，2%利多卡因于穿刺局部逐层麻醉至肝包膜，超声引导下将射频针经皮或开腹刺入肝脏癌灶预定位置；展开射频针，调整半径，通入射频电流，电流强度从小到大、序贯治疗，由计算机根据阻抗控制。若癌灶较大（＞5cm），采取多点、交叉、重叠消融至瘤体完全毁损，以毁损肿瘤及周围0.5～1.0cm的肝组织为目的，最大限度地灭活癌灶，减少残留与复发。

2.3 检测指标 两组患者均于治疗前及治疗后第1、15、30天空腹抽取肘静脉血5mL，部分血抗凝用于检测外周血淋巴细胞亚群比例和红细胞免疫功能；部分血不加抗凝剂，常规制备血清。－20℃条件下保存待用，用于检测免疫相关因子。

采用美国碧迪公司FACSCantoⅡ型流式细胞仪检测患者外周血CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD56+NK细胞的比例，鼠抗人CD3－PE－Cy5/CD4－FITC/CD8－PE三色荧光标记抗体，鼠抗人CD56－PE－CY7荧光标记抗体购自碧迪公司。实验步骤严格按试剂说明书进行，由专门技术员负责流式仪器操作。

采用郭峰等[6]方法测定患者外周血红细胞C3受体花环形成率（RBC－C3bRR）、红细胞黏附肿瘤细胞花环率（RBC－TRR），红细胞吸附免疫复合物花环形成率（RBC－ICR）。酵母多糖冻干试剂，补体致敏酵母多糖冻干试剂，小鼠艾氏腹水癌细胞冻干试剂由本院免疫室提供。

采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定患者外周血血清IL－2、IFN－γ、TNF－α含量。相关ELISA试剂盒均购自北京达科为生物技术有限公司。实验步骤严格按试剂说明书进行。用美国赛默飞世尔科技全波长Multiskan Spectrum酶标仪测定和记录结果。

2.4 统计学方法 应用SPSS17.0软件统计，计量资料用均数±标准差（±s）表示，采用F检验和t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 两组治疗前后外周血淋巴细胞亚群变化比较RFA组与治疗前比较，RFA治疗后第1天，外周血淋巴细胞亚群比例无明显变化（P＞0.05）；治疗后第15天，CD3+T、CD4+T、CD56+NK细胞数目和CD4+/ CD8+比值均升高，与治疗前和治疗后第一天比较，差异有统计学意义（P均＜0.05），CD8+T细胞数目有所降低，但与治疗前和治疗后第一天比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗后第30天，CD3+T、CD4+T、CD56+NK细胞数目和CD4+/CD8+比值均进一步升高，与治疗前和治疗第1天后比较，差异有统计学意义（P均＜0.05），但与治疗后第15天比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。CD8+T细胞数目进一步降低，但与治疗前和治疗后第1、15天比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

手术组与治疗前比较，手术治疗后第1天，CD3+T、CD4+T、CD56+NK细胞数目和CD4/CD8比值略有下降，CD8+T细胞数目略有上升，但差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后第15天，外周血淋巴细胞亚群变化不显著。治疗后第30天，CD3+T、CD4+T、CD56+NK细胞数目和CD4+/CD8+比值均升高，与治疗前和治疗后第1、15天比较，差异有统计学意义（P均＜0.05）；两组CD8+T细胞数目无显著变化（P＞0.05）。见表2。

组间同时期比较，治疗后第15、30天，除CD8+T细胞外，RFA组其他外周血淋巴细胞亚群比例和CD4+/CD8+比值均显著高于手术组（P均＜0.05）。见表2。

3.2 两组治疗前后红细胞免疫功能比较 RFA组治疗后第1天，RBC－C3bRR、RBC－TRR、RBC－ICR与治疗前比较无显著变化（P＞0.05）；治疗后第15、30天后与术前、术后第1天比较，RBC－C3bRR、RBCTRR显著增高，RBC－ICR显著降低，差异有统计学意义（P均＜0.05），但第15、30天之间差异无统计学意义（P＞0.05）。手术治疗后第1、15天后，RBC－C3bRR、RBC－TRR、RBC－ICR与治疗前比较无显著变化（P＞0.05）；手术30天后与治疗前、治疗第1、15天比较，RBC－C3bRR、RBC－TRR显著升高（P均＜0.05），RBCICR显著下降（P＜0.05）。同指标两组间比较，治疗前差异无统计学意义（P＞0.05），治疗后，RFA组红细胞免疫指标与手术组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

3.3 两组治疗前后血清Th1型细胞因子含量比较RFA组血清Th1型细胞因子IL－2、IFN－γ、IFN－α含量治疗15天后升高，与治疗前和治疗第1天后比较差异有统计学意义（P均＜0.05），治疗30天后进一步升高，但与治疗15天后比较差异无统计学意义（P＞0.05）。手术组治疗第1、15天后，血清Th1型细胞因子IL－2、IFN－γ、TNF－α含量与治疗前比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗30天后，Th1型细胞因子含量显著升高，与手术前及术后第1、15天比较，差异有统计学意义（P均＜0.05）。两组间治疗15、30天IL－2、IFN－γ、TNF－α含量比较，差异有统计学意义（P均＜0.05），见表4。

表2 两组治疗前后外周血淋巴细胞亚群比较（%±s）

表2 两组治疗前后外周血淋巴细胞亚群比较（%±s）

注：与治疗前比较，△P＜0.05；与治疗后第1天比较，*P＜0.05；与治疗后第15天相比，▲P＜0.05；与手术组同期比较，□P＜0.05 RFA：超声引导射频消融术

组别RFA组手术组例数45 42治疗前治疗后第1天治疗后第15天治疗后第30天治疗前治疗后第1天治疗后第15天治疗后第30天CD3+T 59.20±8.61 58.52±7.98 71.42±7.07△*□72.39±7.53△*□58.21±9.28 55.8±8.88 60.70±6.44 67.57±5.64△*▲CD4+T 38.24±8.09 37.35±5.28 46.74±4.91△*□48.26±5.85△*□39.23±10.02 36.13±6.77 39.11±4.03 43.05±4.17△*▲CD8+T 21.49±5.91 21.15±5.79 19.01±5.44 18.77±5.30 21.60±13.21 22.3±6.26 21.59±4.36 20.35±3.85 CD4/CD8+ 1.66±0.88 1.69±0.75 2.42±0.56△*□2.61±0.71△*□1.85±0.85 1.62±0.27 1.82±0.33 2.15±0.66△*▲CD56+NK 9.75±6.97 10.56±4.07 19.59±4.89△*□21.18±5.24△*□8.37±5.42 6.48±3.55 9.49±4.05 16.53±5.27△*▲

4 讨论

肝癌患者生存期短，生存质量差。传统治疗手段如手术、化疗、放疗等都无法将患者体内的肿瘤细胞彻底清除，而只是解除或减轻患者的肿瘤负荷，治疗后宿主体内都残留一定的肿瘤细胞，而这些细胞能否被机体清除或形成新的病灶与患者免疫功能呈负相关[7－8]。若机体抗肿瘤免疫功能异常，肿瘤细胞可在免疫监视失控下迅速增殖引起复发或转移。因此，术后患者免疫功能状态与预后有直接关系。然而传统治疗往往较大程度地干扰了患者的免疫功能[9]。

RFA治疗肝癌疗效肯定，作为一种热凝固治疗，其可以增强患者机体抗肿瘤免疫，有利于控制残留肿瘤细胞的增殖，减少复发转移[10]。RFA使病灶发生凝固性坏死，清除免疫抑制因子的来源，解除宿主的免疫抑制状态；治疗创伤小，有利于机体免疫功能的恢复；热疗导致肿瘤细胞表面抗原决定簇暴露或改变，增强肿瘤的抗原性，加上大量坏死肿瘤组织碎片入血，以及热疗刺激热休克蛋白和炎症反应产生等原因，从而加强刺激机体的免疫反应[11]。

研究表明，肝细胞癌患者细胞免疫功能低下，处于免疫抑制状态，表现为外周血各淋巴细胞亚群数目的异常，即机体CD3+、CD4+T细胞、NK细胞和CD4+/CD8+比值明显降低，CD8+T细胞升高。T细胞亚群的变化均与肝细胞癌的恶性程度有关。CD4+T细胞具有辅助和诱导功能，是免疫应答的主要反应细胞；CD8+T是主要的效应细胞，但部分CD8+T细胞具有与CD4+T细胞相反的作用，可使肿瘤逃逸机体的免疫监视；CD4+/CD8+比值可直接反映机体细胞免疫功能状态；而NK细胞在清除循环系统中的肿瘤细胞，防止血行播散中有着重要作用。因此，通过测定这些淋巴细胞亚群数目可较好地反映肿瘤患者免疫状态。文献[12]报道，肝癌患者行RFA术后2周，血清CD4+水平和CD4+/CD8+比值较术前明显升高，而RBC－ICR水平明显降低，RBC－C3bRR、RBCTRR显著升高[13]。Vanagas等[14]研究发现，HCC患者RFA术后7、14天，患者外周血CD3+细胞、CD4+细胞、CD4+/CD8+较治疗前明显升高。上述文献结果表明，RFA后患者免疫功能有一定的改善，但这些研究结果均为2周内变化。本研究结果发现，RFA治疗第15天后，CD3+、CD4+T细胞和NK细胞数目，以及CD4+/CD8+比值即较术前显著升高（P＜0.05）；治疗第30天后，这些指标继续升高。而外科手术治疗第30天后这些指标较术前才有显著升高（P＜0.05）。两组CD8+T细胞数目较术前均有所下降，但并不显著（P＞0.05）。本研究结果说明，RFA治疗后机体抗肿瘤免疫功能短时间内有明显改善，而手术则改善缓慢。同时显示治疗第15、30天后，RFA组患者的CD3+、CD4+T细胞和NK细胞数目，CD4+/CD8+比值均显著高于手术组，说明RFA治疗后患者免疫功能维持于较高水平。

表3 两组治疗前后红细胞免疫功能比较（%，±s）

表3 两组治疗前后红细胞免疫功能比较（%，±s）

注：与治疗前比较，△P＜0.05；与治疗后第1天比较，*P＜0.05；与治疗后第15天比较，▲P＜0.05；与同期手术组比较，□P＜0.05 RFA：超声引导射频消融术

组别RFA组手术组例数45 42治疗前治疗后第1天治疗后第15天治疗后第30天治疗前治疗后第1天治疗后第15天治疗后第30天RBC－C3bRR 9.23±2.41 10.05±2.09 20.34±6.46△*□24.15±6.18△*□9.52±2.49 10.58±2.31 12.70±4.12 17.57±5.37△*▲RBC－TRR 18.02±2.15 17.35±2.68 25.13±3.59△*□27.14±4.65△*□19.42±2.17 18.50±2.79 18.61±3.63 23.60±3.07△*▲RBC－ICR 15.46±3.93 16.56±4.21 8.15±3.58△*□4.21±4.64△*□14.43±4.12 16.23±2.20 12.35±4.43 9.53±4.08△*▲

表4 两组治疗前后Th1型细胞因子含量比较（pg/mL，±s）

表4 两组治疗前后Th1型细胞因子含量比较（pg/mL，±s）

注：与治疗前比较，△P＜0.05；与治疗后第1天比较，*P＜0.05；与治疗后第15天比较，▲P＜0.05；与同期手术组比较，□P＜0.05 RFA：超声引导射频消融术

组别RFA组手术组例数45 42治疗前治疗后第1天治疗后第15天治疗后第30天治疗前治疗后第1天治疗后第15天治疗后第30天IL－2 87.12±10.14 90.15±2.09 98.34±9.82△*□102.25±12.08△*□89.10±8.49 85.15±7.03 87.70±10.02 95.15±9.73△*▲IFN－γ 38.36±7.36 40.65±8.81 55.36±6.49△*□58.38±7.53△*□39.84±6.93 35.05±7.67 42.16±9.25 51.60±11.30△*▲TNF－α 65.12±8.19 63.15±6.51 79.48±8.15△*□80.21±5.16△*□64.14±9.37 66.32±8.72 68.35±8.74 70.55±7.60△*▲

在抗肿瘤细胞免疫反应中，CD4+T细胞处于核心位置，主要分泌Th1型细胞因子。其中Th1型细胞因子IL－2是T细胞生长因子，可活化T细胞和巨噬细胞并诱量T细胞分泌IFN－γ，TNF－α等细胞因子；刺激NK细胞增殖，促进NK细胞分泌IFN－γ；诱导细胞毒性T细胞和自然杀伤T细胞的产生，并增强其肿瘤杀伤活性。本研究结果显示，RFA治疗15天后肝癌患者外周血血清IL－2、IFN－γ、TNF－α浓度显著升高（P＜0.05），30天后继续升高。虽然手术治疗30天后Th1型细胞因子浓度显著升高（P＜0.05），但显著低于同期RFA组（P＜0.05）。说明RFA灭活肝癌组织后较手术治疗更能激活免疫细胞、促进Th1型细胞因子分泌，可产生较为明显的Th1型免疫应答，显著提高患者机体的抗肝癌免疫功能。

肿瘤产生的大量抗原与血中抗体形成的循环免疫复合物，被认为是造成肿瘤免疫抑制的因素之一，而人体清除免疫复合物主要靠红细胞完成。有关临床研究提示，肿瘤是否发生转移与红细胞数量关系不大，而与其免疫功能高低密切相关[15]。本研究中RFA治疗第15天后RBC－ICR较治疗前显著下降（P＜0.05），RBC－C3bRR、RBC－TRR显著升高（P＜0.05），说明黏附在红细胞上的免疫复合物降低及CR1活性增高，导致红细胞对癌细胞的清除能力增强。而手术治疗第30天后患者红细胞免疫指标才有显著改善，且显著低于同期RFA治疗组（P＜0.05）。

总之，RFA治疗可显著改善肝癌患者机体的淋巴细胞和红细胞免疫功能，提高机体免疫功能，从而对肝癌的治疗效果产生有益的影响。虽然手术治疗也可改善肝癌患者免疫功能，但我们认为手术治疗仅打破患者免疫耐受，无助于显著提高患者抗肿瘤免疫功能。

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（收稿：2014－08－03 修回：2014－10－27）

Effects of Radio Frequency Ablation on Immune Function of Hepatic Carcinoma Patients

YAN Jingbin1,YAN Xiumei2,CHEN Bin3,SUN Hongwei3. 1 Department of Ultrasound,Wenzhou Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine,Wenzhou(325000),China;2 Department of Pediatrics,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou(325000),China;3 Department of Ultrasound,the first Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou(325000),China.

Objective To explore the effect of radio frequency ablation（RFA）on post－operative immune function of hepatic carcinoma patients.Methods Eighty seven patients with hepatic carcinoma were randomly divided into two groups:RFA group（n=45）and surgical resection group（n=42）.The percentage of CD3+T cells,CD4+T cells,CD8+T cells and CD56+NK cells and the ratio of CD4+/CD8+T cells in peripheral blood of patients were determined by flow cytometry analysis.Red blood cell C3b receptor rosette（RBC－C3bRR）,tumor red blood cell rosette（RBC－TRR）and red blood cell immune complex rosette（RBC－ICR）were identified to detect the immune function of red blood cells.Thl type cytokines（IL－2,IFN－γ,TNF－α）in the sera were analyzed by ELISA assay. Results Compared to prior－treatment,CD3+,CD4+T cells and NK cells and CD4+/CD8+ratio increased significantly on D15 after RFA（all P＜0.05）and pushed up further on D30.However,they did not increase significantly on D15 after treatment in surgical group（all P＞0.05）and elevated to a significantly different level on D30 after treatment（all P＜0.05）.The percentage of CD8+T cells in both groups decreased on D30 after treatment,but not significantly（all P＞0.05）.On D15 after RFA,RBC－ICR decreased significantly and RBC－C3bRR,RBC－TRR in－creased significantly（all P＜0.05）.However,these immunological indicators in surgical group improved significantly on D30 after treatment（all P＜0.05）,and there are significant difference in them between RFA group and surgical group（all P＜0.05）.Additionally,IL－2,IFN－γ,and TNF－α in the sera raised significantly on D15 after RFA treatment（all P＜0.05）,and they kept on increasing on D30 after RFA.The serum level of these Thl type cytokines increased significantly on D30 after surgical resection（all P＜0.05）,but lower than that in RFA group（all P＜0.05）. Conclusion Compared with surgical treatment,RFA may further improve immune function of lymphocytes and red blood cells of hepatocellular carcinoma patients,promote secretion of Th1 type cytokines,which may benefit the treatment of hepatocellular carcinoma.

Hepatic carcinoma;Radio frequency ablation;Surgical resection;Immune function; Th1 type cytokines

浙江省自然科学基金项目（No.LY12H03005）

1浙江省温州市中西医结合医院超声科（温州 325000）；2温州医科大学附属第二医院儿科（温州 325000）；3温州医科大学附属第一医院超声科（陈斌）、肝胆外科（孙洪伟）（温州 325000）

闫景彬，Tel：0577－88913947；E－mail：48183846@qq.com