硼替佐米对小鼠骨髓树突状细胞的免疫调节作用及其机制探讨

王莹，梁勇，张彦明，吴德沛，刘海燕

(1苏州大学附属第一人民医院，江苏苏州215006;2苏州大学生物医学研究院;3连云港市第一人民医院;4淮安市第二人民医院)

硼替佐米是一种蛋白酶体抑制剂，经体内外实验研究证实，其对多种肿瘤细胞系均有抑制作用。近年来，人们发现其对免疫细胞如T细胞、NK细胞等均具有抑制作用。2013年2月～2014年6月，我们研究了硼替佐米对小鼠骨髓来源的树突状细胞(DC)的免疫调节作用，并探讨了其作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物:SPF级C57BL/6小鼠(雄性，6～8周龄)，体质量18～22 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，层流环境下无菌饲养，每天紫外线照射消毒，饲养笼、食物、饮水均经高压消毒。药物与试剂:硼替佐米(杨森公司赠送)用PBS配制成2.5 mmol/L溶液，避光，于-70℃分装保存，使用前用无血清的PRMI1640培养基稀释为所需浓度。重组小鼠粒—巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)购于杭州隆基生物制品公司;重组小鼠IL-4(rmIL-4)购于PeproTect公司;CCK-8试剂盒为日本同仁化学研究所产品;流式细胞术检测所需荧光抗体均购于BD公司;ELISA试剂盒购于达科为公司;电泳迁移率分析(EMSA)试剂盒为唯奥基因公司产品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓来源DC的制备 按照Inaba等［1］的方法并加以改进。颈椎脱位法处死C57BL/6小鼠，无菌状态下取股骨及胫骨，用1 mL注射器抽取无血清的PRMI1640培养基冲出骨髓细胞，用红细胞裂解液(0.15 mol/L NH4Cl、0.01 mmol/L KHCO3、0.1 mmol/L EDTA-Na2)去除红细胞并洗涤后，培养在含10%胎牛血清(GIBCO公司产品)、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、2 mmol/L谷氨酰胺及 10 ng/mL rmGM-CSF、1 ng/mL rmIL-4 的 PRMI1640培养基内，于37℃、饱和湿度、5%CO2条件下培养。48 h后，吸去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞，加入新鲜的完全培养基及相同浓度的rmGM-CSF及rmIL-4。隔日半量换液，培养至第6天。

1.2.2 CCK-8法检测硼替佐米对DC的抑制率于DC培养的第6天，离心收集悬浮细胞，以5×105/mL接种于96孔板，分别加入2、10、50 nmol/L的硼替佐米，同时设空白对照组，置37℃、饱和湿度、5%CO2的恒温孵箱中培养24、48及72 h后，加入CCK-8试剂10 μL继续培养4 h，用酶标仪在450 nm处读取吸光度值。

1.2.3 流式细胞术检测DC表面共刺激分子的表达 于DC培养的第6天，离心收集细胞，以1×106/mL接种于24孔板，分别加入LPS和(或)2、10、50 nmol/L的硼替佐米，继续培养24 h，离心收集细胞，PBS洗2遍后，每管分别加入FITC标记的仓鼠抗小鼠 CD11c，抗 CD40、抗 CD80、抗 CD86、抗MHCⅡ及小鼠IgG同型对照抗体各1 μL，阴性对照管不加任何抗体。4℃避光放置30 min，加入PBS至0.5 mL，以1 500 r/min离心2 min后弃上清。PBS洗2遍，加入0.5 mL PBS吹打混匀细胞，上流式细胞仪分析。

1.2.43H-胸腺嘧核苷(TdR)掺入法观察异基因淋巴细胞增殖情况 按上述方法培养小鼠骨髓来源的DC至第6天，收集细胞，经过 LPS和(或)2、10、50 nmol/L硼替佐米预处理24 h后，作为刺激细胞，加入浓度为25 ng/mL的丝裂霉素C，37℃孵育30 min，PBS清洗后用RPMI1640培养液重悬，DC浓度调整为 5×105/mL、1×105/mL、5×104/mL。另取BALB/C小鼠脾细胞作为反应细胞，用玻片研磨，裂解红细胞，浓度调整为1×106/mL。两种细胞各取100 μL于U形底96孔培养板中培养，另加rhIL-2(50 U/L)刺激培养。在混合淋巴反应体系(MLR)终止培养16 h前每孔加入培养基稀释的3H-TdR(1 μCi/孔)10 μL。用细胞收集器将每孔培养物分别吸收在玻璃纤维滤纸上，吹风机烘干，然后将滤纸片浸入3 mL脂溶性闪烁液，置于β-液体闪烁记数仪中测定每个样品的每分钟脉冲数(cpm值)。

1.2.5 ELISA法检测DC培养上清及MLR上清液中细胞因子表达 收集LPS和(或)2、10、50 nmol/L的硼替佐米作用24 h后的DC培养上清，用ELISA法检测IL-12、TNF-α的浓度。混合淋巴细胞培养后，收集MLR培养上清，ELISA法检测TNF-α、IFN-γ的浓度。具体方法按照试剂盒操作说明书进行。

1.2.6 电泳造移率分析法(EMSA法)检测DC NF-κB入核活性 于DC培养的第6天，离心收集细胞，以1×106/mL接种于24孔板，分别加入LPS和(或)2、10、50 nmol/L的硼替佐米，继续培养24 h，离心收集细胞，提取核蛋白，测定蛋白浓度，之后按照试剂盒操作说明书进行分析。

1.2.7 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。均数以±s表示，比较采用方差分析。P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 不同浓度硼替佐米在不同时间对DC的抑制作用 见表1。随硼替佐米剂量增加及作用时间延长，对DC的抑制率升高(P均＜0.05)。

2.2 不同浓度硼替佐米对DC表面共刺激分子表达的影响 见表2。

表1 不同浓度硼替佐米在不同时间对DC的抑制作用(%，±s)

表1 不同浓度硼替佐米在不同时间对DC的抑制作用(%，±s)

注:与0 nmol/L比较，*P＜0.05;与2 nmol/L比较，aP＜0.05;与10 nmol/L比较，bP＜0.05;与24 h比较，#P＜0.05;与48 h比较，@P＜0.05。

硼替佐米 抑制率24 h 48 h 72 h 0 nmol/L 5.34± 3.20 10.13± 2.50 21.50± 4.80 2 nmol/L 30.80±37.20* 43.60±10.70*# 70.33±32.50*#@10 nmol/L 57.40±10.80*a 71.17±26.50*a# 82.37±37.60*a#@50 nmol/L 71.23±25.40*ab 83.40±31.80*ab# 85.14±36.50*ab#@

表2 不同浓度硼替佐米对DC表面共刺激分子表达的影响(%，±s)

表2 不同浓度硼替佐米对DC表面共刺激分子表达的影响(%，±s)

注:与 LPS比较，*P ＜0.05。

CD40 CD80 CD86 MHCII处理因素LPS 68.19±13.50 78.02±18.70 73.01±20.40 86.94±18.40 LPS+2 nmol/L硼替佐米 62.14±10.20 72.39±16.20 68.56±15.90 72.51±19.30*LPS+10 nmol/L硼替佐米 48.82± 9.30*47.21±13.60*42.52±10.60*68.31±20.43*LPS+50 nmol/L硼替佐米 22.03± 5.90*35.19±10.10*34.31± 6.40*35.65±12.50*

2.3 不同浓度硼替佐米处理的DC培养上清中TNF-α与IL-12水平比较 见表3。

表3 不同浓度硼替佐米处理的DC培养上清中TNF-α与 IL-12 水平比较(pg/mL，±s)

表3 不同浓度硼替佐米处理的DC培养上清中TNF-α与 IL-12 水平比较(pg/mL，±s)

注:与空白对照及LPS+0 nmol/L硼替佐米比较，*P＜0.05。

处理因素 IL-12 TNF-α 72.30± 15.70 100.09±30.60 LPS+0 nmol/L硼替佐米 467.90±132.20 814.47±93.40 LPS+2 nmol/L硼替佐米 458.54±106.40 688.22±73.60*LPS+10 nmol/L硼替佐米 121.57± 49.60* 376.56±99.90*LPS+50 nmol/L硼替佐米 22.95± 11.80* 85.69±26.80空白对照*

2.4 不同浓度硼替佐米处理的MLR培养上清INF-γ、TNF-α水平比较 见表4。

表4 不同浓度硼替佐米处理的MLR培养上清INF-γ、TNF-α 水平比较(pg/mL，±s)

表4 不同浓度硼替佐米处理的MLR培养上清INF-γ、TNF-α 水平比较(pg/mL，±s)

注:与空白对照及LPS+0 nmol/L硼替佐米比较，*P＜0.05。

处理因素 INF-γ TNF-α 13.67± 5.80 38.27± 10.50 LPS+0 nmol/L硼替佐米 276.58±60.20 574.38±107.20 LPS+2 nmol/L硼替佐米 248.32±56.40 432.57±112.50*LPS+10 nmol/L硼替佐米 196.25±73.58* 407.59± 3.40*LPS+50 nmol/L硼替佐米 68.78±26.60* 350.69± 72.60空白对照*

2.5 不同浓度硼替佐米处理的DC对异基因淋巴细胞增殖能力的影响 LPS、LPS+2 nmol/L硼替佐米、LPS+10 nmol/L硼替佐米、LPS+50 nmol/L硼替佐米处理 MLR后，3H-TdR掺入量分别为(16 843.45 ±720.50)、(14 032.36 ±716.20)、(10 341.56±538.27)、(5472.27±218.34)cpm。与单独LPS比较，其他处理方式均导致3H-TdR掺入量减少，呈浓度依赖性(P均＜0.05)。

2.6 不同浓度硼替佐米对受DCNF-κB入核活性的影响 见图1。经过硼替佐米预处理的imDC在LPS刺激条件下NF-κB入核量减少，并且呈现出浓度依赖性。

图1 EMSA法检测NF-κB入核活性

3 讨论

DC是目前已知体内最重要的抗原递呈细胞，而且也是惟一能激活初始型T细胞的抗原递呈细胞，在特异性免疫应答的诱导中具有独特地位［2］。im-DC位于组织和周围淋巴器官，监视和识别外源性和内源性抗原，并通过吞噬、微吞饮和胞吞作用获取抗原。摄取抗原后，imDC经历成熟过程，并且向周围淋巴器官迁移。在引流淋巴器官中，负载抗原的DC通过 MHCⅡ-抗原肽-TCR复合物活化初始 T细胞［3］。本研究发现，硼替佐米能够抑制DC的生长，并且随着剂量的增加及作用时间的延长，这种抑制效应也增强，呈时间、剂量依赖性。

众所周知，T细胞的活化需两个信号:第一信号由TCR识别APC表面的抗原肽-MHC复合物所启动;第二信号由T细胞和APC间共刺激分子的相互作用所启动。两个信号的整合才可能有效地诱导T细胞活化，而缺乏共刺激信号可致T细胞应答下降，某些情况下可诱导耐受或T细胞失能［4，5］。骨髓来源的前体细胞在GM-CSF和IL-4条件下培育6 d分化成imDC，imDC可以在LPS作用下诱导成成熟DC。DC的成熟伴随抗原递呈分子MHCⅡ类分子和共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达上调，黏附分子和趋化因子也能部分上调表达。本研究结果发现，骨髓源培养的DC经LPS刺激后共刺激分子(CD40、CD80、CD86)高表达，产生成熟的DC。但如果在培养的第6天中加入硼替佐米共育，则DC的成熟将受到抑制，表现为共刺激分子及MHCⅡ类分子表达下调。

DC受到病原微生物等抗原刺激后，除摄取并递呈该抗原外，还能迅速产生并分泌大量的IL-12、TNF-α等细胞因子。IL-12作为信号分子可以促使CD+4T细胞向Th1细胞分化，从而启动了对移植物抗宿主病(GVHD)靶器官的损伤。而TNF-α是GVHD细胞因子网络的重要成员，除可直接引起对宿主组织的损伤外，同时能增强DC表面MHC分子和黏附分子的表达，从而大大增强供者T细胞的活化。我们发现，DC与不同浓度的硼替佐米共育后，其培养上清IL-12、TNF-α表达量降低。表明硼替佐米抑制了DC分泌细胞因子的功能。对于硼替佐米是否能影响DC活化异基因淋巴细胞的能力，我们进行了探讨，结果发现经硼替佐米预处理后的DC与异基因淋巴细胞进行混合淋巴细胞培养后，异基因淋巴细胞的增殖能力明显减弱，而培养上清内，异基因淋巴细胞分泌的TNF-α、INF-γ表达量也降低。说明由于硼替佐米抑制了DC表面共刺激分子的表达，第二信号缺失，从而影响异基因淋巴细胞充分活化增殖。

NF-κB作为核转录因子，在DC的发育、成熟与调节其免疫功能方面发挥重要作用。而之前有文献报道，硼替佐米治疗多发性骨髓瘤的机制之一即以时间和剂量依赖方式阻断IκBα的降解，抑制NF-κB活性。也有文献报道，一些免疫抑制剂可通过抑制NF-κB途径抑制DC功能。所以我们推测，硼替佐米可能也会抑制DC中NF-κB通路，从而抑制DC的功能。本实验结果证实了这个猜想，当经过硼替佐米预处理的imDC在加入LPS后，其NF-κB入核水平随着硼替佐米浓度不断升高而降低。

综上所述，蛋白酶体抑制剂硼替佐米能够通过抑制小鼠骨髓来源的DC内NF-κB的核转移，影响其生长，抵抗LPS诱导的DC成熟，使DC表面共刺激分子的表达减少;同时，硼替佐米也能减弱DC的抗原递呈能力，从而抑制了DC对异基因淋巴细胞的作用。

［1］Inaba K，Inaba M，Romani H，et al.Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor［J］.J Exp Med，1992，176(6):1693-1702.

［2］Reis E，Sousa C.Activation of dendritic cells:Translating innate into adaptive immunity［J］.Curr Opin Immunol，2004，16(1):21-25.

［3］Liu YJ.Dendritic cell subsets and lineages，and their functions in innate and adaptive immunity［J］.Cell，2001，106(3):259-262.

［4］Chen X，Murakami T，Oppenheim JJ，et al.Triptolide，a constituent of immunosuppressive Chinese herbal medicine，is a potent suppressor of dendritic-cell maturation and trafficking［J］.Blood，2005，106(7):2409-2416.

［5］Geoffrey RH，Takanori T，Vivienne I，et al.The p55 TNF-α receptor plays a critical role in T cell alloreactivity［J］.J Immunol，2000，164(2):656-663.