槲皮素对缺血再灌注大鼠肝脏损伤的保护作用

王甲甲，钟佳伶，张娟，黄文芳

(四川省人民医院，成都610072)

肝脏手术中缺血再灌注损伤的程度直接影响手术后肝脏功能及肝脏的存活力，且由于肝脏对缺血比较敏感，因此，有必要对如何减轻肝脏缺血再灌注损伤作深入地探讨［1，2］。槲皮素是常见的类黄酮物质之一，很多研究已证实槲皮素可以通过直接清除活性氧自由基、抑制LDL及DNA氧化损伤等途径发挥抗氧化作用，但对其在缺血再灌注损伤中的应用报道不多［3～5］。2013年 4～8月，本研究利用大鼠肝脏缺血再灌注模型来评价槲皮素对缺血再灌注损伤不同时限肝脏功能和形态学的影响，并对其作用机制作初步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康雄性Wistar大鼠80只，体质量 (250±20)g，被随机分为4组:正常对照组5只、假手术组25只、缺血再灌注组25只和槲皮素组25只，后3组再按不同灌注时限(0、6、12、24、72 h)分为5个亚组，每个亚组5只。

1.2 动物模型的建立 对照组:断颈法处死后直接入腹切肝;假手术组:3%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，经尾静脉输注50 mL/kg生理盐水，开腹后仅游离肝蒂，不作阻断;缺血再灌注组:麻醉及输液同假手术组，解剖肝门，钳夹肝蒂45 min后再复流;槲皮素预处理组:术前经尾静脉输注50 mL/kg槲皮素注射液，麻醉及手术方法同缺血再灌注组。

1.3 标本收集 上述实验结束后，分别收集大鼠的血液于无抗凝剂添加管中，待其凝固后于常温离心机上2 000 r/min，离心5 min收集血清，并分装保存于-20℃冰箱。摘取其肝脏，用剪刀剪成小块分装于2 mL冻存管中，置于-80℃冰箱保存或浸泡于10%的甲醛溶液中固定、石蜡包埋、常规切片备检。

1.4 检测方法 ①肝功能的检测:新鲜大鼠血清于全自动生化分析仪上检测ALT、AST水平;②细胞因子水平的检测:用竞争抑制ELISA法检测血清中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 水平，IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α ELISA试剂盒均购自 R＆D公司，具体操作按照ELISA试剂盒说明书进行，绘制标准曲线，计算各样品中细胞因子的含量;③肝组织病理学分析:HE染色法检测各组肝组织的形态学变化情况;④肝脏细胞凋亡情况的检测:采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的d-UTP缺口末端标记技术(TUNEL)法检测肝脏细胞的凋亡情况。切片在400倍光镜下随机计数6个视野，计算每100个细胞中凋亡细胞所占比例，即凋亡指数(AI)。TUNEL试剂盒购自美国Roche公司。

1.5 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件，数据经正态检验如符合正态分布，以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用重复测量设计的方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组ALT、AST及血清细胞因子水平比较 缺血再灌注组血清中ALT、AST、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平与对照组或假手术组同时间点相比差异有统计学意义(P均＜0.05)，且以12 h组差异最明显;槲皮素组血清中 ALT、AST、IL-1β、IL-8、TNF-α 水平与缺血再灌注组同时间点相比差异有统计学意义(P均＜0.05)。见表1。

表1 各组血清ALT、AST及细胞因子水平比较(±s)

表1 各组血清ALT、AST及细胞因子水平比较(±s)

注:与对照组或假手术组同时间点比较，*P＜0.05;与缺血再灌注组同时间点比较，#P＜0.05。

组别 n ALT(U/L) AST(U/L) IL-1β(μg/mL) IL-6(μg/mL) IL-8(μg/mL) TNF-α(μg/mL)对照组 5 36.42± 5.21 45.27±4.33 31.75± 6.28 51.42± 5.74 62.51±8.25 24.87± 4.11假手术组0 h 5 35.49± 4.16 44.26± 4.02 32.25± 4.05 52.35± 6.01 64.33± 5.77 25.91± 3.60 6 h 5 36.35± 3.85 43.65± 4.75 33.05± 5.73 49.25± 6.94 65.15± 5.16 24.47± 5.64 12 h 5 36.23± 6.72 44.86± 6.24 34.28± 5.41 49.41± 7.01 67.21± 7.47 26.42± 4.05 24 h 5 36.57± 3.86 47.25± 6.22 32.42± 5.82 50.25± 7.97 66.85± 6.48 25.26± 4.22 72 h 5 37.61± 4.70 46.49± 5.15 36.25± 6.65 51.35± 4.73 65.85± 5.49 23.92± 6.08缺血再灌注组0 h 5 92.54± 9.42* 116.27±9.05* 54.68± 5.63* 104.59± 6.35* 121.07± 5.77* 43.33± 8.17*6 h 5 103.21±10.44* 119.35±11.35* 104.05±10.77* 116.36± 9.85* 126.91± 7.09* 94.76± 8.03*12 h 5 125.92±11.88* 135.47±15.46* 122.28± 9.47* 135.52± 9.56* 142.35±11.68* 135.65±12.29*24 h 5 110.35±12.51* 121.21±14.57* 109.66± 9.05* 119.69±11.47* 119.81±12.56* 127.51±12.99*72 h 5 105.18± 9.56* 118.35±10.09* 102.38± 5.42* 116.59±10.27* 118.45±11.06* 109.44±12.49*槲皮素组0 h 5 52.49± 6.47# 64.45±7.21# 40.40±5.23# 95.44± 6.77 71.50±8.74# 36.45± 8.91#6 h 5 59.47± 6.01# 67.71±8.42# 71.41±8.06# 109.24± 7.66 84.37±9.06# 62.38± 5.96#12 h 5 63.32± 8.49# 71.65± 8.75# 86.50± 8.42# 127.58± 9.62 99.46± 8.05# 91.26±13.05#24 h 5 57.35± 6.35# 68.39±7.11# 82.25±6.75# 112.44± 8.05 89.25±6.99# 86.72± 9.75#72 h 5 51.45± 8.28# 67.75± 4.92# 76.48± 8.06# 109.86± 8.75 85.49±10.59# 82.36±11.50#

2.2 肝脏形态学变化 对照组及假手术组肝细胞光镜下观察形态结构正常，未见明显细胞水肿。缺血再灌注组肝脏外观肉眼无明显改变，光镜下肝细胞明显气球样变，肝窦受压，无明显肝索结构，汇管区有大量的淋巴细胞浸润，且伴有部分灶状坏死;再灌注后12 h，坏死程度最严重，细胞形态变化最明显。槲皮素组与缺血再灌注组同时间点相比，肝细胞仅轻度水肿、疏松化，肝窦部分受压，但未见肝细胞坏死。

2.3 TUNEL染色结果 TUNEL染色肝脏凋亡细胞的胞核呈黄褐色，非凋亡细胞的胞核呈蓝紫色。各组肝脏TUNEL染色的AI值分别如下:对照组为(2.05±0.75)%;假手术组0、6、12、24、72 h 分别为(3.15 ±1.05)%、(4.35±1.15)%、(3.65±0.55)%、(3.65±0.65)%、(3.55±0.55)%，各时间点比较差异无统计学意义(P 均 ＞0.05);缺血再灌注组 0、6、12、24、72 h分别为(17.15±2.45)%、(26.25±3.75)%、(23.75±4.65)%、(19.15±3.05)%、(18.45±2.25)%，6 h时最高，组内与其他时间点相比有统计学差异(P均＜0.05);槲皮素组0、6、12、24、72 h 分别为(10.85 ±2.05)%、(12.45±1.95)%、(11.25±0.85)%、(11.35±0.95)%、(10.75±1.45)%，与缺血再灌注组同时间点相比差异有统计学意义(P均＜0.05)。

3 讨论

肝脏缺血再灌注损伤的病理生理机制非常复杂，目前尚未完全阐明。大多数研究认为缺血再灌注损伤与氧自由基生成过多、钙超载、炎症反应、能量代谢障碍、细胞凋亡等有关［6～9］。槲皮素及其衍生物是植物界分布广泛，具有多种生物学功能的黄酮类化合物，其生物学作用包括抗氧化及清除自由基、抗肿瘤、抗炎、抗纤维化作用等［10～12］。目前，关于槲皮素与缺血再灌注损伤之间的研究并不多，且机制不明。本研究旨在探讨槲皮素对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用，也为解决肝脏缺血再灌注损伤提供新的思路，为临床合理利用槲皮素提供一定的实验依据。

在本研究中，我们首先成功地建立了大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型，并对大鼠缺血再灌注损伤及槲皮素处理后0、6、12、24、72 h 5 个时间点大鼠血清中ALT、AST的水平进行检测。ALT、AST是非特异性的细胞内酶，ALT主要存在于肝细胞质中，AST在心肌细胞内含量最高。正常情况下二者血清中含量很低，当肝细胞膜通透性增高时释放入血，这两者常用来反映肝细胞损伤的程度［13，14］。本研究结果显示，肝脏发生缺血再灌注损伤后12 h血清中ALT、AST的水平达到峰值，之后即有所下降。与缺血再灌注组同时间点相比，槲皮素组血清中ALT、AST的水平显著下降。光镜下通过对大鼠肝脏组织形态学的观察发现，对照组和假手术组无明显的形态学变化;在缺血再灌注组，肝脏细胞有大量的坏死，尤以12 h时间点最为严重;而在槲皮素组的相同时间点，肝脏细胞的坏死程度明显减轻。这些研究结果从功能学和形态学方面初步表明槲皮素对大鼠肝脏缺血再灌注损伤有保护作用。

目前，关于缺血再灌注损伤与氧自由基生成过多方面的报道很多［15，16］，而关于缺血再灌注损伤与炎症因子、细胞凋亡方面的报道较少，该研究即着重从这两方面对槲皮素保护大鼠肝脏缺血再灌注损伤的作用机制进行阐述。TNF-α是具有多种生物学效应的重要促炎因子之一，其释放较早，且可激活细胞因子级联反应，诱导白介素和其他次级炎症介质的合成与释放［17］。为了进一步探讨槲皮素保护肝脏作用是否与炎症因子 IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 有关，我们对其相关性作了研究。研究发现，对照组和假手术组这4种炎症因子水平较低，且跟缺血再灌注时间无明确相关关系;槲皮素可能是通过下调IL-1β、IL-8、TNF-α分泌水平发挥其保护肝脏作用。

以往人们普遍认为，肝脏缺血再灌注损伤时细胞以坏死的方式发生死亡。如今更多的观点认为，细胞凋亡在此过程中起重要作用，凋亡已成为当前研究肝脏缺血再灌注损伤发病机制的热点之一［18］。我们对缺血再灌注后不同时间点肝脏的AI进行检测，发现对照组与假手术组AI与时限没有明显相关性。在缺血再灌注组，再灌注后6 h的AI最高，且槲皮素能够有效地减轻肝脏细胞的凋亡程度。这些结果提示槲皮素保护肝脏缺血再灌注损伤的作用可能与抗细胞凋亡有关。

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