改良萋-尼染色法检测分枝杆菌的效果评价

蔡杏珊 王嫩寒 周辉林 张洁 梁启德 田丽丽 许蕴怡 任怡宣 谭耀驹 丁北川



·论著·

改良萋-尼染色法检测分枝杆菌的效果评价

蔡杏珊 王嫩寒 周辉林 张洁 梁启德 田丽丽 许蕴怡 任怡宣 谭耀驹 丁北川

目的 评估改良萋-尼染色液染色镜检分枝杆菌在痰涂片中的检测效能。方法 2014年6月至2014年9月于北京结核病控制研究所和广州市胸科医院顺序纳入就诊，按照临床症状和体征、临床相关检测判断为可疑肺结核病患者835例痰标本共1024份(北京结核病控制研究所435例505份痰标本，广州市胸科医院400例519份痰标本)，分别涂片进行传统萋-尼染色法(三步法)镜检、改良萋-尼染色法(二步法)镜检和简单法固体罗氏培养(L-J法)，比较两种染色方法结果的一致性，并以L-J法结果为金标准，比较两种染色法阳性检出率的差异、诊断的准确性及可操作性。结果 改良萋-尼染色法和传统萋-尼染色法的阳性检出率分别为11.62%(119/1024)和11.91%(122/1024)，差异无统计学意义(χ2=3.18,P>0.05)，两法有良好的一致性(Kappa>0.75)；以L-J法结果为金标准，改良萋-尼染色和传统萋-尼法检测结核分枝杆菌的敏感度和特异度分别为52.94%(90/170)和56.47%(96/170)；97.66%(834/854)和96.96%(828/854)。以上两种方法的ROC曲线下面积分别是0.76和0.77，有中等的诊断价值。结论 改良萋-尼染色法在检出分枝杆菌方面比传统萋-尼染色法有较好的敏感度与特异度，对于诊断肺结核有较好的诊断价值。

结核, 肺/诊断; 结核分枝杆菌； 染色与标记； 显微镜检查; 敏感度与特异度

结核分枝杆菌感染引起的结核病是全世界范围内严重危害人们健康的常见传染病之一[1]。我国是全球结核病高负担国家之一[2]，涂片染色镜检找分枝杆菌的实验室诊断方法因其简单快捷、成本低，目前仍然是我国实施结核病防治规划的重要手段。传统萋-尼染色法(三步法)一直在使用并不断改良[3]，改良萋-尼染色法(二步法)在传统萋-尼染色法的基础上将第二步的盐酸酒精脱色与美兰复染液合二为一，省略了中间一个步骤，因而变得更简捷。为检验改良萋-尼染色法应用效能，本研究通过此方法检测835例疑似肺结核患者的痰标本共1024份，同时与三步法相比较，以简单法固体罗氏培养(L-J培养法)结果为金标准，研究其对分枝杆菌检出的敏感度和特异度，探讨改良萋-尼染色法在实验室的应用前景。

材料和方法

一、标本来源

顺序纳入2004年6月至2014年9月于北京结核病控制研究所和广州市胸科医院就诊，按照临床症状和体征、临床相关检测判断为疑似肺结核患者835例痰标本共1024份(北京结核病控制研究所435例505份痰标本，广州市胸科医院400例519份痰标本)，分别进行涂片传统萋-尼染色法镜检、改良萋-尼染色法镜检和L-J培养法检测。

二、仪器与试剂

1.仪器：光学显微镜为奥林巴斯CX21，产自日本，采用100倍油镜观察。

2.试剂：传统萋-尼染色法染色液和改良萋-尼染色法染色液均由珠海贝索生物技术有限公司提供。酸性罗氏培养基严格按照《全国结核病诊断细菌学检验规程》[4]配制。

三、 方法

(一)痰涂片抗酸染色镜检

取0.20 ml痰标本涂抹制备2张痰膜片，分别进行传统萋-尼染色法及改良萋-尼染色法镜检查找分枝杆菌。操作方法照《中国结核病防治规划—痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》[5]进行。

1.改良萋-尼法操作过程：(1)涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片间距保持10 mm以上的距离；加热固定(在5 s内将玻片经过火焰加热4次)。(2)滴加石碳酸复红溶液(Carbolfuchsin)(第一液)盖满玻片，染色10 min。(3)流水冲去初染色液后，滴加酸性乙醇美蓝溶液(第二液)盖满玻片，脱色1～2 min；如痰膜片过厚，需流水洗去酸性乙醇美蓝溶液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止。流水冲去复染液，沥干水，待玻片干燥后进行镜检。

2.传统萋-尼染色法操作过程[6]：(1)涂片自然干燥后，放置在染色架上。(2)滴加石碳酸复红溶液(第一液)，盖满玻片，火焰加热至出现蒸汽后，脱离火焰，保持染色5 min。(3) 流水冲去第一液后加入脱色剂(第二液)，脱色1 min；如残留块状红色，流水洗去脱色液后再次脱色至痰膜无可视红色为止。(4) 滴加亚甲蓝复染液(第三液)盖满玻片，染色30 s，流水冲去复染液，沥干水，待玻片干燥后进行镜检。

(二)L-J培养法

每份痰标本同时接种于两管酸性罗氏培养基上，具体操作步骤见文献[7]。

四、质量保证

萋-尼染色液及酸性L-J培养法培养基均采用分枝杆菌标准菌株进行染色及生长试验验证，L-J培养法培养基经无菌测试合格后使用。涂片染色及培养过程中均同时采用阴阳性对照进行质量控制，其中涂片染色采用耻垢分枝杆菌标准菌株ATCC11845模似痰作阳性对照，正常人呼吸道分泌物作阴性对照。培养则采用H37Rv结核分枝杆菌标准菌株作阳性、无菌水作阴性对照。对于同一份标本的两种不同方法染色的痰膜片采用盲法进行镜检操作。

五、统计学分析

采用SPSS 19.0对改良萋-尼染色法镜检和传统萋-尼染色法镜检结果进行一致性检验(Kappa检验)，Kappa≥0.75认为两者一致性较好；阳性率的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义；用ROC曲线下面积评价2种染色方法诊断肺结核的价值。完全无价值的诊断试验曲线下面积为0.5，理想的诊断试验曲线下面积为1，而一般认为对于一个诊断试验，ROC曲线下面积在0.5～0.7之间时诊断价值较低，在0.7～0.9之间时诊断价值中等，在0.9以上时诊断价值较高[8]。

结 果

一、传统萋-尼染色法与改良萋-尼染色法的可操作性及镜下比较

改良萋-尼染色法，是将传统萋-尼染色法的脱色液与复染液整合在一起，一液达到脱色与复染双重目的，可操作性比传统萋-尼染色法更强；两法的镜下染色良好，分枝杆菌均呈红色，其他细菌及白细胞、上皮细胞等背景颜色为蓝色(图1、2)。

二、传统-萋尼染色法与改良萋-尼染色法对痰涂片的阳性检出率比较及一致性分析

传统萋-尼染色法与改良萋-尼染色法的阳性率分别是11.91%(122/1024)和10.74%(110/1024)，两者比较差异无统计学意义(χ2=3.18,P>0.05)；对两法进行Kappa检验，Kappa=0.82>0.75,两法具有较好的一致性。

表1 传统萋-尼染色法与改良萋-尼染色法结果比较

三、传统萋-尼染色法与改良萋-尼染色法镜检结果对诊断肺结核患者的价值比较

以L-J培养法检测结果为诊断肺结核的金标准，分析传统萋-尼染色法与改良萋-尼染色法镜检结果的准确性(表2)。传统萋-尼染色法与改良萋-尼染色法的敏感度和特异度分别为56.47%(96/170)和52.94%(90/170)；96.96%(828/854)和97.66% (834/854)(表2)。上述两种方法的检测结果分别与L-J培养法检测结果绘制成诊断肺结核患者的ROC曲线(图3，4)。从图3看出，改良萋-尼染色法诊断肺结核患者的ROC曲线下面积为0.76，与传统萋-尼染色法的0.77相接近，均具有中度的诊断价值。

表2 L-J培养法与传统萋-尼染色法、改良萋-尼染色法结果比较

注 “敏感度”与“特异度”是以“L-J培养法”检测结果为金标准

讨 论

分枝杆菌为细长略带弯曲的杆菌，其细胞壁脂质含量较高，约占干重的60%，特别是有大量分枝菌酸(mycolic acid)包围在肽聚糖层的外面，可影响染料的穿入。萋-尼(Ziehl-Neelsen)染色法广泛应用于结核病的诊断[9]，以5% 石炭酸复红加温染色后可以染上，但用3%盐酸乙醇不易脱色[10]。若再加用美蓝复染，则分枝杆菌呈红色，而其他细菌和背景中的物质为蓝色。本研究的改良萋-尼染色法，采用特殊的渗透剂使复红能快速穿透结核分枝杆菌表层屏障，使菌体着色牢固、同时将传统萋-尼染色法的脱色液与复染液结合在一起，—95%乙醇、3%盐酸、0.5%亚甲兰，省略了一个染色环节，减少操作者的生物安全危险性，同时达到脱色与复染的双重目的，而且镜下染色结果与传统萋-尼染色法同样清晰。

本研究表明：传统萋-尼染色法与改良萋-尼染色法的阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)；两法的一致性较好(Kappa>0.75),说明改良萋-尼染色法可以媲美于传统萋-尼染色法。但仍有38例两种方法检测结果互相不符合，其中25例是传统法阳性改良萋-尼染色法阴性，13例是改良萋-尼染色法阳性传统法阴性，原因可能是改良萋-尼染色法对于操作者来说还是新方法，第二液的脱色复染的时间掌握得不够好，脱色时间稍有延长，抗酸性较弱的分枝杆菌初染红色会被脱掉，同时美蓝上色过深也影响了镜检结果，造成了少量改良萋-尼染色法的假阴性；另外分枝杆菌在痰液中分布的不均一性或菌量少于5000～10 000条/ml，也是两种染色方法结果部分差异的原因。

以L-J培养检测结果为金标准，进一步分析传统萋-尼染色法与改良萋-尼染色法检测结果的准确性，本研究说明改良萋-尼染色法虽可媲美于传统法，但与金标准“L-J培养”检测结果比较，两种染色方法检测的敏感度较差[11]，但特异度则比较高。

综上所述，改良萋-尼染色法镜下菌体色彩鲜明、对比度强、背景清晰，对分枝杆菌的检出率可媲美于传统萋-尼染色法，有较好的敏感度与特异度，在诊断结核病上有较好的准确度，而且比传统萋-尼染色法省略了一个步骤，可以减少操作，缩短时间、提高工作效率，增加生物安全系数，是一种简单、安全、准确的分杆菌菌涂片染色方法。但在操作过程中需注意掌握好第二液的脱色复染时间，方可提高涂片镜检的阳性率。

[1] World Health Organization. Global tuberculosis control: surveillance, planning, financing: WHO report 2008. Geneva: World Health Organization, 2008.

[2] 赵雁林，尚美. 我国当前结核病实验室诊断的现状. 中华检验医学杂志，2007,30(7)：97-98.

[3] 吴敏，艾义明.结核杆菌抗酸染色中美兰与孔雀绿复染液比较.中国防痨杂志，2007，29(3)：288-289.

[4] 中国防痨协会基础委员会.结核病诊断实验室检验规程.中国教育文化出版社，2006：30-45.

[5] 中国疾病预防控制中心.中国结核病防治规划——痰涂片镜检质量保证手册. 北京：中国协和医科大学出版社，2004.

[6] 赵雁林.结核菌痰涂片显微镜检查标准化培训教材.人民卫生出版社,2009:10-14.

[7] 赵雁林．分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册．北京：人民卫生出版社，2013：4．

[8] 虞仁和．SPSS18及其医学应用．长沙：中南大学出版社，2013：232-233.

[9] 张登才,刘斌,张丽华.等.抗酸染色在结核病病理诊断中的价值. 中国防痨杂志,2014,36(4):274-278.

[10] 张娴. 萋-尼氏抗酸染色法的操作改良及效果. 浙江预防医学,2010,22(10)：95-96.

[11] Van Deun A,Hamid Salim A，Aung KJ,et a1．Performance of variations of carbolfuchsin staining of sputum smears for AFB under field conditions．Int J Tuberc Lung Dis, 2005, 9(10):1127-1133．

(本文编辑：范永德)

《中国防痨杂志》协办单位名单(名单顺序按照协议签署时间排列)

1.北京金之路医药科技有限公司

2.北京结核病控制研究所

3.山东省胸科医院

4.武汉市结核病防治所

5.沈阳双鼎制药有限公司

6.西安市结核病胸部肿瘤医院

7.深圳市龙华新区慢性病防治中心(精神卫生中心)

本刊编辑部

Evaluation of improved Ziehl-Neelsen acid-fast staining method for detecting mycobacteria

CAIXing-shan*,WANGNen-han,ZHOUHui-lin,ZHANGJie,LIANGQi-de,TIANLi-li,XUYun-yi,RENYi-xuan,TANYao-ju,DINGBei-chuan.

*GuangzhouChestHospitalClinicalLaboratory,Guangzhou510095，China

DINGBei-chuan,Email:bchding@163.com；TANYao-ju，Email:gzchtan@163.com

Objective To assess the efficiency of improved Ziehl-Neelsen (ZN) acid-fast staining method to detect mycobacteria in sputum. Methods A total of 1024 sputum specimens of 835 suspected pulmonary tuberculosis patients from Beijing Institute of TB Control TB control(505 sputum specimens of 435 patients) and Guangzhou Chest hospital(519 sputum specimens of 400 patients) from June 2014 to September 2014 were detected by conventional ZN acid-fast staining method (3 step method), improved ZN acid-fast staining method (2 step method) and Lownstein-Jenson (L-J) culture respectively. Setting the L-J culture as golden standard, the positive rate, diagnostic accuracy and operability were compared between two staining methods. Results The positive rate of improved ZN acid-fast staining method and conventional ZN acid-fast staining method was 11.62%(119/1024) and 11.91% (122/1024), respectively. No difference was observed between two group (χ2=3.18,P>0.05), and they have good consistency (Kappa>0.75). The sensitivity and specificity were 52.94% (90/170) and 97.66% (834/854) for improved ZN method, and 56.47% (96/170) and 96.96% (828/854) for conventional method, respectively. The areas under the ROC curve of these two methods were 0.76 and 0.77, respectively, demonstrating that both of them had medium diagnostic value. Conclusion Our results show that improved ZN acid-fast staining method has better sensitivity and specificity for detecting mycobacteria, which can provide favorable diagnostic value in the diagnosis of pulmonary tuberculosis.

Tuberculosis, pulmonary/diagnosis;Mycobacteriumtuberculosis； Staining and labeling； Microscopy; Sensitivity and specificity

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.06.006

广州市科技计划项目(201508020007)

510095 广州市胸科医院检验科(蔡杏珊、周辉林、梁启德、许蕴怡、谭耀驹)；北京结核病控制研究所检验科(王嫩寒、张洁、田丽丽、任怡宣、丁北川)

丁北川，Email:bchding@163.com；谭耀驹，Email:gzchtan@163.com

2015-04-30)