Xpert Mtb/RIF检测技术诊断肺结核和肺外结核的价值

李妍 张天华 鲜小萍 王西娣 陈美玲 杨健 王蕊



·论著·

Xpert Mtb/RIF检测技术诊断肺结核和肺外结核的价值

李妍 张天华 鲜小萍 王西娣 陈美玲 杨健 王蕊

目的 探讨利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert Mtb/RIF)在结核病诊断中的临床应用价值。 方法 对200例初治结核病患者标本，包括痰液、肺泡灌洗液、胸腹腔积液和脑脊液各50例，分别进行抗酸染色法、固体培养法、药物敏感性试验(简称“药敏试验”)及Xpert Mtb/RIF检测，分别以固体培养结果和药敏试验结果为金标准，分析Xpert Mtb/RIF检测标本中结核分枝杆菌及其利福平耐药性的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和Kappa值。Xpert Mtb/RIF检测和金标准检测进行一致性检验(Kappa检验)，Κ>0.8认为两者一致性极好。结果 以固体培养法检测结果为准，Xpert Mtb/RIF检测技术，以及抗酸染色法总体敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、Kappa值分别为94.52%(69/73)、90.55%(115/127)、85.19%(69/81)、96.64%(115/119)和0.83，以及65.75%(48/73)、96.06%(122/127)、90.57%(48/53)、82.99%(122/147)和0.66；以比例法药敏试验结果为准，Xpert Mtb/RIF检测技术检测利福平耐药性的总体敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和Kappa值分别为93.75%(15/16)、100.00%(53/53)、100.00%(15/15)、98.15%(53/54)和0.96。 结论 Xpert Mtb/RIF法可快速检测肺内、外结核分枝杆菌及其耐药性，具有良好的应用前景。

结核, 肺/诊断； 结核/诊断； 抗药性, 细菌； 利福平； 微生物敏感性试验； 核酸扩增技术

结核病是危害人类健康的传染病之一，其早期诊断更具有临床意义，因此，寻找一种快速、简便和敏感度高的检测方法显得尤其迫切。随着分子生物学技术的发展，越来越多的分子诊断技术不断的涌现，利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert Mtb/RIF)便是其中之一。该方法国内以痰标本为研究对象研究较多，而对肺外结核的应用报道尚少[1-2]，所以该方法还有许多未知领域值得探讨。本课题将抗酸染色法、固体培养法和Xpert Mtb/RIF检测技术在肺内、外标本中的检测情况进行比较，初步评价该技术检测结核分枝杆菌及利福平耐药的应用效果，报告如下。

资料和方法

一、材料

200例初治结核病患者标本，来自我所及陕西省结核病防治院2014年3月至2015年2月，经临床或细菌学检查确诊[3]的门诊和住院结核病患者。包括痰液、肺泡灌洗液、胸腹腔积液和脑脊液各50份。标本采取前未使用抗结核药物治疗。

二、仪器和试剂

GeneXpert Dx仪器、 GeneXpert Mtb/RIF Cartridge检测盒(批号：16201)及样品试剂(sample reagent，SR)(批号：3244C034)均购自美国Cepheid公司；分枝杆菌涂片镜检萋-尼氏染色液(批号：4140424)、中性罗氏培养基(批号：20140912)和分枝杆菌药物敏感性试验(简称“药敏试验”)培养基(批号：20140912)均购自珠海贝索生物技术有限公司。

三、方法

所有标本同时采用抗酸染色法、固体培养法、比例法药敏试验及Xpert Mtb/RIF检测。

1. 抗酸染色法：采用离心浓缩法，操作参照《结核病实验室标准化操作与网络建设》[4]进行。

2. 固体培养法：采用中和离心法，操作参照《结核病实验室标准化操作与网络建设》[4]进行。

3. 药敏试验及菌种鉴定：采用比例法，操作参照《结核病实验室标准化操作与网络建设》[4]进行。

4. Xpert Mtb/RIF技术：取1 ml标本加入前处理管中，视标本性状加入2倍标本体积的SR标本处理液，涡旋振荡15～30 s，静置15 min。打开检测盒，吸取2 ml处理后样品缓慢加入检测盒，然后将检测盒放入检测模块，仪器开始进行自动化测试。反应结束后，在检测系统窗口下可直接观察测试结果。

四、统计学方法

用SPSS 16.0软件进行统计学处理。率之间的比较采用χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。Xpert Mtb/RIF检测和金标准检测进行一致性检验(Kappa检验)，K≤0.40时，表明一致性较差；0.40≤K≤0.60时，表明中度一致；0.600.8认为两者一致性极好。

结 果

一、采用抗酸染色法、固体培养法、Xpert Mtb/RIF技术检测Mtb结果

200份不同类型样本(包括痰液、肺泡灌洗液、胸腹腔积液和脑脊液各50份)同时采用抗酸染色法、固体培养法和Xpert Mtb/RIF技术检测，总体阳性检出率分别为26.50%(53/200)、36.50%(73/200)和40.50%(81/200)。Xpert Mtb/RIF技术总体阳性率(40.50%)高于抗酸染色法阳性率(26.50%)，两者差异有统计学意义(χ2=8.80,P<0.01)；高于固体培养法阳性率(36.50%)，两者差异无统计学意义(χ2=0.68,P>0.05)；抗酸染色法阳性率(26.50%)与固体培养法阳性率(36.50%)比较，差异有统计学意义(χ2=4.63,P<0.05)。(表1)。

二、采用抗酸染色法、Xpert Mtb/RIF技术检测Mtb结果

200份不同类型样本同时采用3种检测方法检测。以固体培养法检测结果为准，Xpert Mtb/RIF技术检测总体敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为94.52%(69/73)、90.55%(115/127)、85.19%(69/81)和96.64%(115/119)，对Xpert Mtb/RIF技术和固体培养法进行Kappa检验，K=0.83，两者具有极好的一致性(表2)。

表1 3种检测方法对不同样本的阳性检出率比较

注a：固体培养法相比较；b：与Xpert Mtb/RIF技术相比较；c：与抗酸染色法相比较

表2 不同样本Xpert Mtb/RIF检测技术检测Mtb的结果(以固体培养法检测结果为准)

表3 不同样本抗酸染色法检测Mtb的结果(以固体培养法检测结果为准)

以固体培养法检测结果为准，抗酸染色法检测总体敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为65.75%(48/73)、96.06%(122/127)、90.57%(48/53)和82.99%(122/147)，对抗酸染色法和固体培养法进行Kappa检验，K=0.66，两者有较好一致性(表3)。

三、Xpert Mtb/RIF技术检测RFP耐药的结果

所有样本通过固体培养共得到73例阳性菌株，经菌种初步鉴定，其中有4例为非结核分枝杆菌(NTM)，其余69例均为Mtb。最终可进行Xpert RIF比对分析的结核分枝杆菌为69例。69例结核分枝杆菌，Xpert Mtb/RIF技术与药敏试验分别有15例和16例耐RFP结核分枝杆菌，耐药率分别为21.74%(15/69)和23.19%(16/69)，二者间差异无统计学意义(χ2=0.04,P>0.05)。两种方法检测对RFP均敏感者53例，均耐药者15例，二种方法所得结果一致率为98.55 %(68/69)。

以药敏试验结果为准，采用Xpert Mtb/RIF技术检测69例阳性标本中RFP的耐药性，其敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为93.75%(15/16)、100.00%(53/53)、100.00%(15/15)和98.15%(53/54)，对Xpert Mtb/RIF技术和药敏试验进行Kappa检验，K=0.96，两者具有极好的一致性(表4)。

表4 Xpert Mtb/RIF技术检测RFP耐药性的结果 (以比例法药敏试验结果为准)

讨 论

一、Xpert Mtb/RIF技术的检测原理及特点

在我国，结核病传统的诊断方法有涂片镜检和分枝杆菌培养等。涂片法简单、快速，但容易漏检，尤其对于含菌量较低的肺外标本更是难以检出[5]。培养法是检测Mtb的“金标准”，但耗时长。至于药敏试验，目前常用的方法有绝对浓度法或比例法，但需要2～3个月才能获到结果，往往影响患者用药时间。近年来出现的Xpert Mtb/RIF新技术，该技术对结核分枝杆菌利福平耐药决定区rpoB基因设定引物和探针，进行扩增检测，根据其是否发生基因突变来检测标本中是否含有结核分枝杆菌及结核分枝杆菌是否对利福平耐药。整个过程只需2 h，是将PCR所需的3个步骤即样品准备、扩增和检测集于一体的半巢式多重实时荧光半定量检测技术。该方法快速、简便，对生物安全要求相对较低，最大程度地减少了操作中污染的可能性。

二、Xpert Mtb/RIF技术检测肺结核及肺外结核的效能分析

研究表明，Xpert Mtb/RIF技术对肺结核的诊断价值已经逐步得到证实[6]，其敏感度为 90.40%、特异度为98.40%，但对肺外诊断研究尚不一致。本实验选用200例肺内、外结核患者的4种类型标本进行检测，以固体培养为金标准，肺内痰标本和肺泡灌洗液的敏感度和特异度分别为97.50%(39/40)、80.00%(8/10)，95.24%(20/21)和82.76%(24/29)，与张治国等[1]和高漫等[7]报道的敏感度稍高、特异度稍低。原因可能与本实验的选取标本例数较少有关，也可能与入选对象标准不同有关，这就需要在敏感度和特异度之间寻找平衡点。肺外标本中，采用Xpert Mtb/RIF技术，胸腹腔积液敏感度87.50%(7/8)高于Tortoli 等[8]报道的44.40%；脑脊液的敏感度为75.00%(3/4)低于Tortoli等[8]报道的85.70%；总体特异度为90.55%(115/127)略低于Vadwai等[9]报道的97.00%。上述差异可能与本实验选取的标本数量较少有关，也可能与实验的金标准不同有关，此研究还有待于在今后的工作中继续完善和补充。

三、Xpert Mtb/RIF技术与抗酸染色法、固体培养法及药敏试验比较的优势

有报道Xpert Mtb/RIF技术的临床检出限为131菌落形成单位(CFU)/ml[10]，抗酸染色镜检检出限为5×103CFU/ml以上，培养为10～100 CFU/ml[11]。本实验同时采用抗酸染色、固体培养及Xpert Mtb/RIF法，4种不同类型标本均以Xpert Mtb/RIF法阳性率最高，其次为培养法，抗酸染色法阳性率最低；并且以固体培养法检测结果为准，Xpert Mtb/RIF技术的总体敏感度94.52%(69/73)高于抗酸染色法敏感度65.75%(48/73)，Xpert Mtb/RIF技术与固体培养法的一致性(Κ=0.83)高于抗酸染色法与固体培养法的一致性(Κ=0.66)。本研究结果还显示，以药敏试验检测结果为准，Xpert Mtb/RIF和药敏试验具有极好的一致性，该结果与Boehme 等[1]的报道基本一致。因此，Xpert Mtb/RIF技术相对于传统抗酸染色、培养技术而言，不但提高了敏感度，而且最大程度上缩短了检测时间，尤其对结核分枝杆菌的耐药性检测更具优势。

Xpert Mtb/RIF检测技术是世界卫生组织(WHO)及国家结核病参比实验室推荐的一种全新的结核病快速检测新方法，具有快速、简单和敏感度高，而生物安全要求不高，且能同时检测利福平耐药菌株等优点，尤其对于阳性检出率极低的肺外标本更具临床意义。然而，该技术所用仪器、试剂价格昂贵，其后续模块维护校准也需较大费用。因此，在资源允许及结核病高发地区，Xpert Mtb/RIF技术的临床应用价值较高，对结核病的早期诊断及规范化治疗能够起到很好的作用。

[1] 张治国，欧喜超，孙倩，等．利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术检测痰标本中结核分枝杆菌及其耐药性的研究．中国防痨杂志，2013，35(1)：13-16．

[2] 赵冰，欧喜超，夏辉，等．Xpert Mtb/RIF检测技术在结核病诊断中的应用评估．中国防痨杂志，2014，36(6):462-466．

[3] 中华医学会．临床诊疗指南-结核病分册．北京：人民卫生出版社，2005：1-46，122．

[4] 赵雁林，刘志敏．结核病实验室标准化操作与网络建设．北京：人民卫生出版社，2013：227-280．

[5] 贾留群，龙虹羽，胡倩婧，等．Xpert MTB/RIF 试验对肺外结核诊断价值的 Meta分析．中华临床医师杂志，2013, 7(6): 2587-2591．

[6] Chang K，Lu W，Wang J，et al．Rapid and effective diagnosis of tuberculosis and rifampicin resistance with Xpert MTB/RIF assay: a meta-analysis．J Infect，2012，64(6): 580-588．

[7] 高漫，邹远妩，白广红，等．Xpert Mtb/RIF Assay在结核病诊断中的应用．国际检验医学杂志，2015，36(3)：413-414．

[8] Tortoli E，Russo C，Piersimoni C，et al. Clinical validation of Xpert MTB/RIF for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis．Eur Respir J，2012，40(2)：442-447．

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[10] Helb D，Jones M，Story E，et al．Rapid detection ofMycobacteriumtuberculosisand rifampin resistance by use of on-demand, near-patient technology．J Clin Microbiol，2010，48(1)：229-237．

[11] 李辉，谭耀驹，李洪敏，等.利福平耐药实时荧光定量核酸检测技术的诊断效果对比研究.中国防痨杂志，2014，36(6)：472-476.

(本文编辑：范永德)

The value of Xpert Mtb/RIF detection assay in the diagnosis of pulmonary tuberculosis and extrapulmonary tuberculosis

LIYan，ZHANGTian-hua，XIANXiao-ping，WANGXi-di，CHENMei-ling，YANGJian，WANGRui.

Referencelaboratory，ShaanxiProvincialInstituteforTuberculosisControlandPrevention，Xi’an710048，China

ZHANGTian-hua，Email：zhthfzhk@126.com

Objective To investigate clinical value of XpertMycobacteriumtuberculosis/Rifampicin(Xpert Mtb/RIF)assay on detection of tuberculosis. Methods We tested 200 samples from initial treatment of tuberculosis patients including sputum, bronchoalveolar lavage fluid, Hydrothorax and ascites, cerebrospinal fluid, each of which had 50 cases, respectively. These samples were detected by acid-fast stain，solid culture，proportional method drug sensitivity tests and Xpert Mtb/RIF assay. Using solid culture result and drug sensitivity tests result as gold standard respectively. The sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive values andKappavalue of Xpert Mtb/RIF assay in detecting Mycobacterium and refampin resistance were analyzed. In the consistency test for Xpert Mtb/RIF assay and the gold standard test (Kappatest), both of the two test had an excellent agreement whenkappavalue was more than 0.8. Results According to the solid culture result as gold standard, the sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive values andKappaof Xpert Mtb/RIF assay and acid-fast stain in detecting tuberculosis were 94.52%(69/73)，90.55%(115/127)，85.19%(69/81)，96.64%(115/119) and 0.83 and 65.75%(48/73)，96.06%(122/127)，90.57%(48/53)，82.99%(122/147) and 0.66 respectively. According to the drug sensitivity tests result as gold standard, the sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive values andKappain detecting refampin resistance are 93.75%(15/16)，100.00%(53/53)，100.00%(15/15)，98.15%(53/54) and 0.96. Conclusion Xpert Mtb/RIF assay has a good application prospect in rapidly detecting pulmonary and extrapulmonary tuberculosis and refampin resistance.

Tuberculosis, pulmonary/diagnosis； Tuberculosis/diagnosis； Drug resistance, bacterial； Rifampin； Microbial sensitivity tests； Nucleic cid amplification techniques

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.06.003

陕西省卫生厅资助项目(2014D25)

710048 西安，陕西省结核病防治研究所参比实验室(李妍、王西娣、陈美玲、杨健、王蕊)，所长办公室(张天华、鲜小萍)

张天华，Email：zhthfzhk@126.com

2015-04-10)