琼脂扩散试验的影响因素及注意事项

刘坤洋

琼脂扩散试验包括琼脂双向单扩散试验和琼脂双向双扩散试验，后者是最常用的琼脂扩散试验，一般用于抗体或抗原的定性检测，其原理是可溶性抗原与相应的抗体（抗血清）在琼脂凝胶中向四周自由扩散，如果抗原和抗体相对应，则在二者比例适当处形成肉眼可见的白色沉淀线，反之则不会出现沉淀线。常用已知抗原检测未知的血清样本，也可用已知抗血清检测未知抗原样本。

1 琼脂扩散试验的影响因素

1.1 琼脂板的制备

琼脂板的质量、浓度、黏度、厚度、湿度等都会影响琼脂扩散试验的结果，琼脂浓度越低，则孔径越大，扩散速度也会越快；如果琼脂浓度越大，那么琼脂的黏度也会随之增大，扩散速度会相对减慢，建议使用较好的琼脂（琼脂糖），最适浓度为1%，厚度约2.5毫米，注意倒热融化琼脂液时不要产生气泡，而且空气中的湿度很低，琼脂中的水分容易蒸发，待琼脂冷凝后加盖，把平皿倒置，放在装有湿纱布的搪瓷盘中，防止水分蒸发，保证湿度。

1.2 打孔

打孔是琼脂扩散试验中的关键，反应孔应现用现打，放在4℃冰箱中过夜后再使用。实验室常用梅花打孔器，然后用针头挑出内容物。用此种方法在打孔的过程中，注意挑出空内容物时避免将凝胶划破，否则可造成孔与孔之间产生裂痕，产生错误的实验结果。如果试验检测的样品数量不是很多，还可以将若干梅花打孔器先放在空平皿中，孔口朝下，向平皿中倒入稍冷却的热融化琼脂液，之后迅速并平稳地放入4℃冰箱中，冷却后取出平皿，逐个轻轻拔出打孔器，根据实验需要重复此操作。打孔后用酒精灯轻烤平皿底部进行封底时，在酒精灯上来回几次，以平皿不烫手（微热即可）为宜，若是塑料平皿要注意烤的时间不要过长，以免变形，待琼脂刚刚融化为止，防止琼脂板与平皿底部脱离导致阳性血清、被检血清及抗原相互串通，避免出现模糊的沉淀环，影响实验结果。

1.3 加样

在加样之前，首先在琼脂板上标记好实验日期及样品编号，加样过程中小心谨慎，每个样品加完后都要换枪头，避免产生小气泡，需要注意的是每孔会因受人工操作的影响在封底时各孔的容积不同，在加样时注意不要让样品溢出导致液体混合。如果大批量检测样品，必须将被检血清、阳性血清和抗原先后加入一个梅花孔后再加入下一个梅花孔，防止加入的时间间隔太长而扩散的时间不同进而影响抗原抗体结合及沉淀线的产生。

1.4 判定结果

当标准阳性血清和抗原孔之间只有一条明显致密线时，被检血清与抗原孔形成沉淀线，或阳性血清的沉淀线向相邻的被检血清的抗原侧偏弯，则被检血清为阳性。如果被检血清没有出现任何沉淀带，或出现的沉淀带与阳性对照沉淀带完全交叉者判为阴性。观察时需借助强光源，调整角度、方位直到阳性血清和抗原孔之间出现清晰白色沉淀线则试验成立，否则应重做。

2 注意事项

2.1 温度

温度对整个试验也会有影响，制备琼脂板时融化琼脂时需在水浴中进行，注意防止在加热过程中由于水分的蒸发而影响溶液的浓度，在琼脂中加入0.01%的硫柳汞防止细菌污染，避免腐败。在一定条件下，温度越高扩散越快，通常反应在0～37℃下进行，在试验中为保证沉淀线清晰度防止沉淀线变形，可在37℃下形成沉淀线，然后置于4℃条件下。

2.2 时间

扩散时注意时间，时间过短不能出现沉淀线，时间太长会导致沉淀线解离或散开出现假阴性而影响实验结果，沉淀线的形成一般在24小时、48小时、72小时观察并记录，过久会出现沉淀线消失。

2.3 其他因素

不规则的沉淀线可能是加样过满溢出、打孔时孔型不规则、边缘开裂、孔底渗漏、抗原抗体浓度不同、孵育时平皿未放平等等，所以在做琼脂扩散试验时一定要设立对照，以免出现假阳性。