Runx3、Smad4、Cdk2、p21 在胃癌中的表达及其临床意义

刘 雷 陈国昌 宋振云 郜恒骏 陈卫昌

江苏省宜兴市人民医院消化内科1(214200) 生物芯片上海国家工程研究中心2苏州大学附属第一医院消化科3

转化生长因子-β(TGF-β)信号通路为一重要的细胞内信号转导通路，参与胚胎发育、肿瘤发生、创伤愈合、炎症反应等多种生理和病理生理过程。Runx3和Smad4是近年发现的抑癌基因，两者为TGF-β信号通路中的关键分子，其异常表达与多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关［1-2］。p21和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)同样在TGF-β信号通路中发挥重要作用，p21可通过抑制CDKs复合物活性协调细胞周期、DNA修复、细胞凋亡等因素，进而对肿瘤产生影响［2-3］。近年来，组织芯片技术已越来越多地应用于恶性肿瘤相关研究，本研究应用组织芯片技术联合免疫组化方法检测并分析Runx3、Smad4、Cdk2、p21在胃癌中的表达及其与胃癌临床病理特征和预后的关系，探讨四者在胃癌中的生物学意义及其用于胃癌预后判断的临床价值。

材料与方法

一、标本来源

收集苏州大学附属第一医院2004年10月-2007年5月胃癌根治手术标本130例，其中男101例，女29例，年龄27 ～80岁，平均(62.7 ±15.2)岁。入选病例术前均未行化、放疗，诊断经术后病理检查证实，病史资料完整，出院后通过电话、信件随访，截止日期为2011年10月1日。共获得癌组织石蜡块130例，癌旁组织248例(距肿瘤边缘2 cm以内和5 cm以外各124例)，胃癌组织学分型和临床病理分期分别参照2000年WHO推荐的分型标准和2002年第6版UICC/AJCC TNM分期。

二、组织芯片制作

供体组织蜡块常规切片、HE染色，由病理专家作二次诊断，并在切片上标记典型病变部位。使用组织芯片制作仪(Beecher Instruments Inc.)在受体蜡块(空白蜡块)上打孔(直径1.0 mm和1.5 mm)，根据HE染色切片上标记的病变部位，在供体组织蜡块的相应位置获取相同直径的组织芯，置入受体蜡块阵列孔中，记录组织编号。每块组织取2个组织芯，共制成4块阵列块，4μm厚连续切片，组织芯片切片中的每个点均经病理诊断证实。

三、免疫组化染色和结果判断

兔抗人Runx3、Cdk2多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，鼠抗人Smad4单克隆抗体购自R＆D Systems，Inc.，鼠抗人p21单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发有限公司。采用EnVision二步法，严格按试剂盒(DAKO公司)说明书进行操作。于光学显微镜下随机选取5个高倍视野，计数不少于1000个细胞，计算染色细胞百分率。异常表达判断标准均参照相关文献:①Runx3，细胞核出现棕黄色或褐色颗粒，染色细胞≥10%为正常表达，＜10%为异常表达;②Smad4，细胞质和(或)细胞核出现黄色或褐色颗粒，染色细胞≥50%为正常表达，＜50%为异常表达;③Cdk2，细胞膜、细胞质或细胞核出现棕黄色颗粒，染色细胞≤10%为正常表达，＞10%为异常表达;④p21，细胞核出现棕黄色或褐色颗粒，染色细胞＞5%为正常表达，≤5%为异常表达。

四、统计学分析

应用SPSS 16.0统计软件，计数资料以率或构成比表示，组间比较采用χ2检验或Fisher精确概率法;相关性的分析采用 Spearman秩相关系数;以Kaplan-Meier法绘制生存曲线并计算生存率，两组间比较采用log-rank检验;以Cox比例风险模型行预后因素分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、Runx3、Smad4、Cdk2、p21 在不同胃组织中的表达

130 例胃癌组织中，Runx3、Smad4、Cdk2、p21 异常表达率分别为 67.7%、35.4%、63.8% 和 70.0%，248 例癌旁组织中则分别为 14.1%、12.5%、18.1%和37.1%，组间差异均有统计学意义(P＜0.05)。将癌旁非癌组织根据病理诊断分组作进一步分析，从正常胃组织、慢性非萎缩性胃炎、慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生、异型增生至胃癌，四种蛋白异常表达率大致呈上升趋势，其中正常胃组织、慢性非萎缩性胃炎、慢性萎缩性胃炎和肠上皮化生组织均显著低于胃癌组织(P＜0.05)，而异型增生组织仅Runx3异常表达率显著低于胃癌组织(P＜0.05)，Smad4、Cdk2、p21异常表达率与胃癌组织无明显差异(P ＞0.05)(图1、表1)。

二、Runx3、Smad4、Cdk2、p21 表达与胃癌临床病理特征的关系

分析显示，Runx3异常表达与胃癌组织学分型和淋巴结转移有关(P＜0.05)，与患者性别、年龄、肿瘤大小、部位、浸润深度和TNM分期无关((P＞0.05);Smad4和p21异常表达仅与胃癌组织学分型有关(P ＜0.05)，与性别、年龄、肿瘤大小、部位、淋巴结转移、浸润深度和TNM分期无关(P＞0.05);Cdk2异常表达与胃癌组织学分型、淋巴结转移和TNM分期有关(P＜0.05)，与性别、年龄、肿瘤大小、部位和浸润深度无关(P＞0.05)(表2)。

三、胃癌组织中 Runx3、Smad4、Cdk2、p21 表达的相关性

130例胃癌组织中，Runx3与Smad4均异常表达者45例，均正常表达者41例，两者呈正相关(rs=0.387，P＜0.05);Runx3与p21均异常表达者85例，均正常表达者36例，两者呈正相关(rs=0.840，P＜0.05);Runx3与Cdk2均异常表达者78例，均正常表达者37例，两者呈负相关(rs= －0.312，P ＜0.05);Smad4与p21均异常表达者43例，均正常表达者36例，两者呈正相关(rs=0.298，P ＜0.05);Smad4 与Cdk2均异常表达者26例，均正常表达者27例，两者间无相关性(rs= －0.089，P＞0.05);Cdk2与 p21均异常表达者52例，均正常表达者8例，两者间无相关性(rs= －0.211，P ＞0.05)。

四、Runx3、Smad4、Cdk2、p21 表达与胃癌患者生存率的关系

130例患者随访53～84个月，中位随访期65个月，死亡74例，失访12例，随访率为90.8%，总体中位生存时间为32个月，5年生存率为37.3%。Runx3、Smad4、p21异常表达组5年生存率分别显著低于相应正常表达组(P＜0.05)，Cdk2异常表达与正常表达组间5年生存率无明显差异(P＞0.05)(表3)。Cox比例风险模型多因素分析显示，在各项潜在预后因素(性别、年龄、肿瘤大小、部位、组织学分型、淋巴结转移、浸润深度、TNM分期以及Runx3、Smad4、Cdk2、p21 表达)中，Runx3 和 Smad4为胃癌患者的独立预后因素。

图1 Runx3、Smad4、Cdk2、p21在正常胃组织和胃癌组织中的表达(免疫组化EnVision二步法，×200)

表1 Runx3、Smad4、Cdk2、p21在不同胃组织中的异常表达情况n(%)

表2 Runx3、Smad4、Cdk2、p21表达与胃癌临床病理特征的关系(n)

表3 Runx3、Smad4、Cdk2、p21异常表达与正常表达组生存情况比较

讨 论

TGF-β信号通路在恶性肿瘤的发生、发展中起重要作用，该通路相关分子主要包括TGF-β受体(TβRⅠ、Ⅱ、Ⅲ)、Runx3、Smad4、Cdk2、p21、p27、cmyc等［2］。在 TGF-β-Smad 信号转导过程中，Runx蛋白(包括Runx3)介导Smads复合物从胞质转入胞核，两者共同参与细胞分化、细胞凋亡、细胞周期等的调控［4］。研究发现Runx3失活可引起小鼠胃黏膜上皮细胞增殖增强和凋亡抑制，导致胃黏膜异常增生甚至癌变，Runx3的抑癌机制至少部分与协同TGF-β-Smad 信号诱导 p21 表达有关［5］;胃癌组织中Smad表达明显下调，并与预后不良有关［6］。Runx3与Smad4协同诱导p21表达，使细胞周期阻滞于G1期，p21表达激活又可抑制Cdk2、Cdk4，进一步发挥抑癌作用。由此可见，TGF-β信号通路中的Runx3、Smad4、Cdk2、p21之间存在相互影响。本研究分析了这四种蛋白在胃癌和癌旁组织中的表达情况、四者与胃癌临床病理特征和预后的关系以及四者间的相关性，发现胃癌组织中Runx3、Smad4、p21表达下调或缺失，Cdk2表达上调，四者分别与胃癌组织学分型、淋巴结转移、TNM分期中的一项或多项有关;除Cdk2仅与 Runx3相关外，Runx3、Smad4、p21三者的异常表达两两相关，且均与预后不良有关，其中Runx3和Smad4是胃癌患者的独立预后因素。

本组130例胃癌组织中67.7%存在Runx3异常表达，而248例癌旁组织中Runx3异常表达率仅为14.1%，从正常胃组织、慢性胃炎、癌前病变(肠上皮化生和异型增生)至胃癌的演进过程中，Runx3异常表达率逐步上升，提示Runx3或可作为早期胃癌的预测指标，对结直肠肿瘤的研究同样显示Runx3失活是结直肠癌发生的早期事件［7］，与本研究结果一致。肝细胞癌组织中亦存在Runx3表达下调或缺失［8］。本研究中Smad4异常表达率从正常胃组织至癌前病变上升趋势并不明显，从癌前病变至胃癌则有较明显的增加，提示Smad4失活属于癌变晚期分子事件，与国外文献报道一致［9］。

Cdk2是CDKs蛋白家族的重要成员，作为细胞周期正性调节因子，在多种恶性肿瘤中表达上调，增加肿瘤细胞的恶性表型和侵袭性［10］。p21为CDKs抑制剂之一，既往观点认为其可诱导细胞周期阻滞，抑制肿瘤细胞生长，然而近年研究却发现p21在前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌以及多种鳞状细胞癌中呈高表达，表明p21在不同恶性肿瘤中可呈现抑癌或促癌活性［3］。本研究发现p21在胃癌中表现为抑癌活性，p21表达正常的胃癌患者5年生存率显著长于表达低下者。p21在不同恶性肿瘤中发挥不同作用可能与以下因素有关［3］:①p21基因多态性导致其功能的多样性，且 p21受 p53、Cdk2、Smads等多种分子影响;②p21可通过激活E2F、抑制Cdk2而抑制细胞周期，但同时又可抑制细胞凋亡，调节多种转录因子表达，参与DNA修复。

综上所述，本研究发现TGF-β信号通路中的Runx3、Smad4、Cdk2、p21 可相互影响并可能在胃癌的发生、发展中起一定作用，其中Runx3、Smad4、p21表达与胃癌患者的生存期有关，异常表达组5年生存率显著低于正常表达组，Cox比例风险模型提示Runx3和Smad4为胃癌患者的独立预后因素。然而，胃癌发生的影响因素众多，本研究标本选取时未剔除术前曾服用中药者以及幽门螺杆菌(Hp)感染病例(Hp感染可能对TGF-β信号通路产生激活作用)，且Runx3、Smad4、p21之间存在两两相关关系，因此Runx3和Smad4能否作为判断胃癌患者预后的指标之一，尚有待进一步研究。

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4 Zaidi SK，Sullivan AJ，van Wijnen AJ，et al.Integration of Runx and Smad regulatory signals at transcriptionally active subnuclear sites［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99(12):8048-8053.

5 Chi XZ，Yang JO，Lee KY，et al.RUNX3 suppresses gastric epithelial cell growth by inducing p21(WAF1/Cip1)expression in cooperation with transforming growth factor{beta}-activated SMAD［J］.Mol Cell Biol，2005，25(18):8097-8107.

6 陆斌，周永宁，李强，等.胃癌组织 TGF-βRⅡ、Smad4、Smad7的表达及其与临床病理特征和生存的关系［J］.癌症，2009，28(5):538-542.

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8 Li X，Zhang Y，Zhang Y，et al.RUNX3 inhibits growth of HCC cells and HCC xenografts in mice in combination with adriamycin［J］.Cancer Biol Ther，2008，7(5):669-676.

9 Maitra A，Molberg K，Albores-Saavedra J，et al.Loss of Dpc4 expression in colonic adenocarcinomas correlates with the presence of metastatic disease［J］.Am J Pathol，2000，157(4):1105-1111.

10 Hongo F，Takaha N，Oishi M，et al.CDK1 and CDK2 activity is a strong predictor of renal cell carcinoma recurrence［J］.Urol Oncol，2014，32(8):1240-1246.