岩藻多糖抑制小鼠心肌梗死后的心脏重构

王晓玲，陈曼华

(华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院 心血管内科，湖北 武汉430014)

岩藻多糖是裙带菜主要成分之一，具有抗凝血、抗病毒、抗血管生成、抗肿瘤、调节免疫活性[1-2]、抗凋亡[3]、抗氧化应激[4]及抑制炎性反应等多种生物学作用[5]。岩藻多糖抑制炎性反应及抗氧化应激的活性引起了广泛关注[5]。有研究报道岩藻多糖还具有抗氧化应激及保护DNA 损伤的作用[6]。

心肌梗死后心脏重构是患者发展成为心力衰竭最主要的机制[7-8]。心肌梗死后存活心肌的炎性反应以及氧化应激在其发展成为心力衰竭的过程中发挥着重要作用[9]。岩藻多糖具有抑制炎性反应及抗氧化应激的作用，其在心肌梗死后心室的重构中的作用尚未阐明，本实验探讨岩藻多糖在心肌梗死后心室重构中的作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:SPF级雄性C57BL/6J 小鼠，6～8周龄，体质量20～25 g[南京医科大学实验动物中心;合格证号:SCXK(苏)-2012-0002]。

1.1.2 试剂:岩藻多糖(北京雷力联合海洋生物科技有限公司，纯度99.7%)，埃文斯蓝(BioSharp 公司)，三苯基氯化物(TTC，Amresco 公司)，Trizol(Invitrogen 公司)，反转录试剂盒(Roche 公司)，SDSPAGE 凝胶配制试剂盒(谷歌公司)，eNOS、NF-κB、GAPDH 一抗、荧光标记羊抗鼠二抗(Cell Signaling公司)，PVDF膜(Millipore 公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物处理:将小鼠随机分为以下4 组:1)假手术组:行冠状动脉左前降支结扎术，开胸后只挂线，不结扎冠状动脉，术后给予0.9%氯化钠溶液灌胃，同药物处理(n =10);2)心肌梗死模型组:结扎冠状动脉左前降支建立该模型(n =20);3)＆ 4)低和高浓度岩藻多糖处理组:心肌梗死术后每日灌胃分别给予200 和500 mg/kg 岩藻多糖处理，持续给药3 周(均n =20)。所有小鼠3周后断椎处死取心脏。

1.2.2 RT-qPCR检测SOD、和iNOS 以及TNFα、IL-1β和TGFβ mRNA的表达:用Trizol 提取心肌的总RNA，用寡聚引物和反转录试剂盒将每组2 mg的总RNA 反转录为cDNA。把反转录产物稀释3倍，利用LightCycler 480 SYBR Green 实时荧光定量PCR 仪进行PCR 反应。每个样品设3个复管。将其结果与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的表达进行对比，以2－△△Ct计算mRNA的表达。

1.2.3 Western blot检测eNOS 和NF-κB蛋白表达:心脏经研磨后离心，超声裂解细胞，离心后取上清液，用BCA法定量各组蛋白浓度。每组取20 μg 蛋白质裂解液进行电泳，在6%～10% SDS-PAGE 凝胶上分离，转移到PVDF膜上，将膜用含有5%脱脂牛奶在室温下孵育1 h，用一抗孵育过夜，然后用二抗孵育1 h，用二色红外成像系统扫描蛋白印迹，检测每组上诉蛋白的表达水平。同样每组蛋白表达水平用GAPDH 蛋白的表达校准，结果以目的蛋白/内参蛋白吸光度的均数±标准差(±s)表示(n=6)。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 岩藻多糖提高小鼠心肌梗死后的存活率，改善心功能，减少心肌梗死面积

岩藻多糖处理组术后存活率明显高于模型组小鼠(病死率50%)(P＜0.05)，低浓度和高浓度岩藻多糖小鼠死亡率分别为20%和25%。与模型组相比岩藻多糖明显减小左室收缩末内径(LVESd)和左室舒张末内径(LVEDd)，增加左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(LVFS)，高浓度岩藻多糖的效果优于低浓度组。MI 术后3 周岩藻多糖处理的小鼠心重/体质量(HW/BW)和肺重/体重(LW/BW)明显低于模型组，高浓度岩藻多糖作用更加明。岩藻多糖处理后的小鼠心脏心肌梗死面积明显小于模型组，高浓度岩藻多糖处理组心肌梗死面积最小(表1)。

2.2 RT-qPCR检测心脏炎性因子及SOD 和iNOS mRNA的表达

与假手术组相比，模型组术后心肌TNFα、IL-1β、TGFβ 及iNOS mRNA表达明显增加，而SOD的mRNA表达降低。岩藻多糖能降低模型组心脏炎性因子TNFα、IL-1β、TGFβ 及iNOS mRNA表达，高浓度岩藻多糖明显增加SOD的mRNA表达，低浓度岩藻多糖无明显影响(表2)。

表1 各组小鼠心功能、心重及心肌梗死面积的比较Table1 The cardiac function，heart weight and myocardial infarct size in each group (±s)

表1 各组小鼠心功能、心重及心肌梗死面积的比较Table1 The cardiac function，heart weight and myocardial infarct size in each group (±s)

*P＜0.05 compared with sham group;#P＜0.05 compared with model group.

group LVESd/mm LVEDd/mm LVEF/%LVFS/%HW/BW(mg/g)LW/BW(mg/g)infraction size/%sham(n=10) 2.35±0.18 3.33±0.06 79.00±1.83 42.30±2.15 4.18±0.25 4.57±0.18 －model(n=20) 4.96±0.76* 5.86±0.49* 48.80±6.83* 23.00±2.41* 8.54±1.51* 8.60±0.71* 52.32±7.15*fucoidan(200 mg/kg)(n=20) 3.67±0.80* # 4.35±0.18* # 64.30±5.54* # 31.50±3.30* # 6.77±0.75* # 6.32±0.49* # 40.14±7.82* #fucoidan(500 mg/kg)(n=20) 3.15±0.27* # 3.95±0.09* # 68.60±2.54* # 35.90±0.58* # 5.76±0.13* # 5.96±0.27* # 38.66±6.88*#

表2 小鼠心脏炎性因子TNFα、IL-1β、和TGFβ 及iNOS 和SOD mRNA表达Table2 The mRNA expression levels of inflammation factors (±s，n=3)

表2 小鼠心脏炎性因子TNFα、IL-1β、和TGFβ 及iNOS 和SOD mRNA表达Table2 The mRNA expression levels of inflammation factors (±s，n=3)

*P＜0.05 compared with sham group;#P＜0.05 compared with model group.

group TNFα(×10 －4) IL-1β(×10 －3) TGFβ(×10 －2)iNOS SOD sham 8.39±1.97 2.30±1.16 1.78±1.25 25.12±1.32 1 199±3 model 37.31±3.34* 4.24±0.90* 4.97±0.25* 59.03±0.37* 575±3*fucoidan(200 mg/kg) 18.35±1.69* # 2.75±0.83* # 3.25±0.16* # 37.50±0.66* # 716±2* #fucoidan(500 mg/kg) 12.43±1.71* # 2.62±1.54* # 2.11±0.44* # 33.52±0.62* # 1 007±2*#

2.3 Western blot检测

模型组NF-κB的表达增高(P＜0.05)，而磷酸化eNOS表达下降;高浓度岩藻多糖处理组NF-κB的表达显著下降(P＜0.05)，而磷酸化eNOS的表达趋于正常(图1，表3)。

图1 小鼠心脏eNOS 及NF-κB的蛋白表达Fig1 The expression levels of eNOS and NF-κB

表3 小鼠心脏eNOS 及NF-κB的蛋白表达Table3 The expression levels of eNOS and NF-κB(±s，n=6)

表3 小鼠心脏eNOS 及NF-κB的蛋白表达Table3 The expression levels of eNOS and NF-κB(±s，n=6)

*P＜0.05 compared with sham group;#P＜0.05 compared with model group.

hroup p-NF-κ B/GAPDH p-eNOS/GAPDH sham 0.02±0.02 0.09±0.01 model 0.35±0.06* 0.43±0.03*fucoidan(200 mg/kg) 0.03±0.02* # 0.10±0.02* #fucoidan(500 mg/kg) 0.06±0.02* # 0.06±0.02*#

3 讨论

缺血引起的心肌纤维化、炎性反应和细胞凋亡是心肌梗死后左心室心肌重构的必要因素。而一些促炎因子在心肌重构的发病过程中发挥着关键作用，例如转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和IL-1β，抑制这些细胞因子的表达可以减缓心肌重构的进程。NF-κB是转录调节因子，在心血管疾病中发挥着多种作用，包括调节炎性反应、细胞存活、分化和增殖[10]。本研究表明岩藻多糖可以抑制上述炎性因子的mRNA表达，减少NF-κB的活化，从而抑制心肌梗死后的心脏重构。

氧化应激在心肌梗死后心脏重构中也发挥重要作用[11]。SOD是生物体内重要的抗氧化酶，是生物体内清除自由基的首要物质，在心肌梗死后心脏重构的过程中伴随着SOD的表达下降，体内氧自由基清除减少，从而加重了心肌重构的病理过程。在心肌梗死后的心脏重构过程中iNOS的表达增加，刺激机体产生更多的活性氮，增加心脏的氧化应激损伤。eNOS 为内源性NOS，活化的eNOS 途径可诱导eNOS的磷酸化，增加NO 合成。这种eNOS 和NO可通过调节血管保护心脏重构以及血管生成[12]。本结果表明岩藻多糖能增加心肌梗死后小鼠心脏SOD的表达，减少iNOS mRNA的表达，增加活化的的eNOS的蛋白表达，证明岩藻多糖可以通过增强体内抗氧化应激的作用有效减缓心肌重构。

本实验证实了岩藻多糖可以减缓心肌梗死后的心脏重构，其机制主要是通过其抗炎及抗氧化应激作用。而岩藻多糖是否能减缓心肌梗死后的心肌纤维化尚需要进一步证实。

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