上皮剪接调节蛋白1(ESRP1)在人卵巢癌组织及细胞系的表达

袁成福，李志红，彭 帆，肖方祥

(三峡大学 医学院 生物化学教研室，湖北 宜昌443002)

卵巢癌是危害广大妇女健康最常见的恶性肿瘤之一。人上皮剪接调节蛋白1 (epithelial splicing regulatory protein 1，ESRP1)通过与富含UGG的序列结合，可促进上皮基因亚型的选择性剪接，如成纤维细胞生长因子受体2 (fibroblast growth factor receptor 2，FGFR2)[1]。近期研究表明:人乳头瘤病毒HPV16 癌蛋白E5 可通过ESRP1 诱导FGFR2b 向FGFR2c 亚型的转换，从而使宫颈癌细胞发生上皮间质转化及转移，这表明ESRP1 可能和宫颈癌转移事件有关[2]。ESRP1 在卵巢癌中是否具有作用以及具有怎样的作用，目前没有文献报道。本研究拟检测卵巢癌组织及细胞系中ESRP1表达水平，及其与FGFR2 亚型转换的关系，为研究ESRP1 在卵巢癌中的作用及分子机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源:24例新鲜切除的卵巢癌手术标本均来自三峡大学附属第一医院病理科。该标本的获取已得到患者签署的知情同意书，并获得三峡大学伦理委员会的审查批准。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:正常卵巢上皮细胞OSE、永生化的卵巢上皮细胞IOSE120T、IOSE398、卵巢癌细胞A2780、OVCAR3、OVCAR5、SKOV3、OVCAR8 及卵巢畸胎瘤PA-1 细胞常规培养于37℃、5% CO2培养箱中。

1.2.2 PCR检测相关基因表达:常规提取总RNA、反转录、PCR扩增目的基因。

1.2.3 Western blot检测ESRP1蛋白的表达:从部分新鲜标本提取蛋白后，进行常规Western blot 实验。

1.3 统计学分析:使用SPSS 统计软件，计量资料以均数±标准差(±s)表示，均数比较用方差分析，若方差不齐，采用秩和检验。

2 结果

2.1 PCR检测不同卵巢癌细胞系中ESRP1 mRNA的表达:在正常卵巢上皮细胞OSE、永生化的卵巢上皮细胞IOSE120T、IOSE398 及卵巢癌A2780 细胞中，ESRP1 mRNA表达水平较低;在卵巢癌细胞OVCAR3、OVCAR5 中ESRP1 mRNA表达水平较高;在卵巢癌SKOV3、OVCAR8 及卵巢畸胎瘤PA-1 细胞中ESRP1 mRNA的表达介于中间水平(图1)。

图1 不同卵巢癌细胞系中ESRP1 mRNA表达的PCR 结果Fig1 ESRP1 mRNA expression levels in different ovarian cancer cell lines were determined by PCR

2.2 Real time PCR检测不同卵巢癌临床样本中ESRP1 mRNA的表达:在24例卵巢癌组织中有19例ESRP1 mRNA的表达显著高于对应的正常卵巢组织(图2)。

图2 Real time PCR检测不同卵巢癌临床样本中ESRP1 mRNA的表达水平Fig2 ESRP1 mRNA expression levels were determined in different ovarian cancer tissues by real time PCR(±s，n=3)

图3 Western blot检测部分卵巢癌临床样本中ESRP1蛋白的表达Fig3 ESRP1 protein expression levels were determined in different ovarian cancer tissues by Western blot

2.3 Western blot检测部分卵巢癌临床样本中ESRP1蛋白的表达:在所选的6例卵巢癌组织中ESRP1蛋白的表达均显著高于对应的癌旁正常卵巢组织(图3)。

2.4 Real time PCR检测不同卵巢癌细胞系中FGFR2b及FGFR2c 亚型的表达:在正常卵巢上皮细胞OSE、永生化的卵巢上皮细胞IOSE120T、IOSE398 及卵巢癌A2780、SKOV3、OVCAR8 及卵巢畸胎瘤PA-1 细胞中，主要表达FGFR2c 亚型;在卵巢癌细胞OVCAR3、OVCAR5 中主要表达FGFR2c 亚型(图4)。

图4 Real time PCR检测不同卵巢癌细胞系中FGFR2b 及FGFR2c 亚型的表达Fig4 FGFR2b and FGFR2c mRNA expression levels were determined in different ovarian cancer cell lines by real time PCR(±s，n=3)

3 讨论

ESRP1能调控其靶基因FGFR2的选择性剪接[3]。FGFR2有两种亚型，即FGFR2b 与FGFR2c，FGFR2b代表上皮型细胞表型，而FGFR2c代表间质型细胞表型。ESRP1 可调控FGFR2b 向FGFR2c的亚型转换[2]，因此，推测ESRP1可调控细胞上皮间质转化(epithelial to mesenchymal transition，EMT);而EMT是肿瘤侵袭转移的早期事件，这表明ESRP1 可能与肿瘤的侵润转移事件相关。卵巢癌具有较高的转移性，那么ESRP1 在卵巢癌事件中是否发挥重要作用?目前没有相关文献报道。

本研究中，用real time PCR检测发现在24例卵巢癌标本中，有19例ESRP1 mRNA的表达显著高于对应正常的癌旁组织;部分标本的Western blot 结果也显示ESRP1 在卵巢癌中的表达高于对应正常的癌旁组织，这表明ESRP1 可能在卵巢癌事件中发挥重要作用。本研究中PCR检测发现在OSE、IOSE120T、IOSE398 A2780 细胞中，ESRP1 mRNA表达水平较低;OVCAR3、OVCAR5细胞中ESRP1 mRNA表达水平较高;在SKOV3、OVCAR8 及PA-1 细胞中ESRP1 mRNA的表达介于中间水平，这和临床标本的检测结果具有一致性。同时也发现在ESRP1表达较低或处于中间水平的OSE、IOSE120T、IOSE398、A2780、SKOV3、OVCAR8、PA-1 细胞中，主要表达FGFR2c 亚型，而在ESRP1表达较高的OVCAR3、OVCAR5 中主要表达FGFR2b 亚型，这表明在卵巢癌中，ESRP1 与FGFR2 亚型转换有关;并且这种亚型转换很可能是以“全或无”方式进行。FGFR2 亚型转换是肿瘤恶性表型的基础[4]，因此，ESRP1 在卵巢癌事件中的作用很可能是通过FGFR2 亚型转换而实现的。

[1]Warzecha CC，Sato TK，Nabet B，et al.ESRP1 and ESRP2 are epithelial cell-type-specific regulators of FGFR2 splicing[J].Mol Cell，2009，13:591-601.

[2]Ranieri D，Belleudi F，Magenta A，et al.HPV16 E5 expression induces switching from FGFR2b to FGFR2c and epithelial-mesenchymal transition[J].Int J Cancer，2015，137:61-72.

[3]Warzecha CC，Jiang P，Amirikian K，et al.An ESRP-regulated splicing programme is abrogated during the epithelialmesenchymal transition [J].EMBO J， 2010， 29:3286-3300.

[4]Zhao Q，Caballero OL，Davis ID，et al.Tumor-specific isoform switch of the fibroblast growth factor receptor 2 underlies the mesenchymal and malignant phenotypes of clear cell renal cell carcinomas[J].Clin Cancer Res，2013，19:2460-2472.