Y-27632抑制胃癌SGC-7901细胞系侵袭与转移

赵 敏，周 颖，黄江梅，肖 芳，李晓超，张 辉，刘瑞吉

(秦皇岛市第一医院 病理科，河北 秦皇岛066000)

胃癌是严重威胁人类生命的恶性肿瘤，近年来其发病率和病死率有明显上升的趋势。血清应答因子(serum response factor，SRF)是一个重要的转录因子，调控涉及细胞增殖、迁移、分化、血管发生和凋亡等方面的多种基因的表达。最近研究发现其在肝癌、大肠癌和甲状腺癌组织中高表达，可能参与肿瘤的发生、发展及侵袭、转移。SRF 自身转录活性相对较低，需与辅因子结合后发挥调控靶基因的作用。MRTF-A (myocardin-like protein 1)是SRF 重要的辅因子之一。Rho 相关卷曲螺旋蛋白激酶(Rho associated coiled coil protein kinase，ROCK)通过Rho 信号传导通路激活MRTF 信号，促进MRTF-A(MAL)转位入核，激活SRF 依赖的转录[1-3]。Y-27632是ROCK 特异性通路阻断剂，研究表明其对细胞黏附、张力纤维形成及肌动球蛋白依赖的细胞运动具有调控作用。本研究检测ROCK 阻断剂Y-27632对胃癌SGC-7901细胞系增殖和迁移的影响，并研究其作用机制是否是通过对SRF 调控来实现的。

1 材料与方法

1.1 材料

SGC-7901 胃癌细胞系(中科院上海细胞库)。siRNA、RNAi-Mate 转染试剂(上海吉玛制药技术有限公司)。Y-27632(Cayman 公司)。ROCK1(EPIT MICS 公司)。E-cadherin、β-catenin、F-actin、MRTFA 和Cyclin D1(Santa Cruz 公司)。

1.2 方法

1.2.1 胃癌SGC-7901细胞系的常规培养、转染及实验分组:用含10%胎牛血清的RPMI1640 培养基，在37℃、5% CO2浓度、饱和湿度培养箱内培养胃癌SGC-7901细胞系。每2～3 天传代1次。取对数增殖期细胞，按1.5×104/孔接种在96 孔培养板上，60 mm 培养瓶细胞调整为1.0×106/瓶。在培养箱内培养至96孔板及60 mm 培养瓶中癌细胞汇合率应达到70%～80%。0.2%胎牛血清同步化24 h。按照上海吉玛制药技术有限公司《RNAi 产品使用手册》进行转染，siRNA-SRF 基因序列:正义5'-GCAAGGCACUGAUUCAGACTT-3'，反义5'-GUCUG AAUCAGUGCCUUGCTT-3'。转染条件详见表1。细胞在37℃、5% CO2浓度、饱和湿度条件下继续培养48 h后，进行分组。

表1 不同细胞培养环境的转染条件Table1 The condition of transfection in different cell-culture circumstance

将细胞分为:1)对照组:无血清培养基;2)Y-27632 通路阻断剂组:无血清培养基+Y-27632(10、20 和30 μmol/L;3)siRNA-SRF-1107 干扰组:无血清培养基+siRNA。各组均孵育48 h。

1.2.2 CCK-8 法检测增殖情况:各组细胞加入10 μL/孔CCK-8;37℃培养箱中培养3 h;用酶标仪测定450 nm 吸光度值，并计算抑制率(抑制率=1 －实验组OA值/空白对照组OA值×100%)。

1.2.3 侵袭实验:在Transwell 小室滤膜上加入75 μL matrigel(0.5 mg/mL)。收集各组细胞，离心重悬调整细胞为1×105cell/mL，在Transwell 小室上层加入200 μL 单细胞悬液，下室沿侧壁加入600 μL含10%胎牛血清的1640 培养基。37℃，5%CO2培养24 h。取出小室，小心去除滤膜表面未穿膜的细胞。乙醇固定，HE染色。镜下计数侵袭细胞数，取5个视野的平均值。以侵袭细胞的相对数目反映细胞的侵袭能力。

1.2.4 划痕实验:制备各组细胞悬液，按照4×105cell/孔种植于24孔板。待细胞汇合后，超净台内用200 μL 枪头在细胞表面划痕，尽量保持笔直。按照实验设计诱导，每组设6个复孔。48 h后镜下观察，照相，进行定性分析。

1.2.5 Western blot检测:提取各组蛋白，按BCA法测定蛋白浓度。SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。再将蛋白转移至醋酸纤维素膜(PVDF)膜上。37℃摇动封闭1 h后，滴加封闭液稀释的一抗，4℃过夜。充分洗涤后，滴加辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃孵育1 h。充分洗涤后，加入BCIP/NBT 显色剂显色。用扫描仪对PVDF膜上蛋白表达条带进行扫描，经Image J 图像分析软件测量条带的OA值，以目的蛋白OA值/内参蛋白OA值比值的均值±标准差(±s)来表示。

1.3 统计学分析

实验数据使用SPSS 13.0 软件处理，主要统计指标进行正态性检验，正态分布的各个统计指标均以均数±标准差(±s)表示。多组间统计学差异显著性采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用LSD 法。

2 结果

2.1 不同浓度Y-27632对胃癌SGC-7901细胞系增殖的影响

分别予以胃癌SGC-7901细胞系10、20 和30 μmol/L Y-27632 孵育，随着Y-27632浓度的增高，细胞增殖略有下降，抑制率分别为4.1%、7.2%和15.3%，而针对SRF的siRNA转染组细胞增殖受限(P＜0.05)。在10～30 μmol/L 范围内Y-27632对胃癌SGC-7901细胞增殖没有影响(表2)。选择20 μmol/L Y-23762 进行后续实验研究。

2.2 Y-27632对胃癌SGC-7901细胞系侵袭能力和迁移能力的影响

与对照组相比，Y-27632 能够显著抑制肿瘤细胞的侵袭，与siRNA-SRF-1107 组具有类似的效应，侵袭细胞数明显减少(P＜0.05)。Y-27632和siRNASRF 均能显著抑制胃癌SGC-7901细胞的迁移能力(P＜0.05)(表3，图1)。

表2 Y-27632对SGC-7901细胞系增殖的影响Table2 The effect of Y-27632 on proliferation of SGC-7901 cells

表3 Y-27632对SGC-7901细胞系侵袭能力的影响Table3 The effect of Y-27632 on invasion of SGC-7901 cells(±s，n=6)

表3 Y-27632对SGC-7901细胞系侵袭能力的影响Table3 The effect of Y-27632 on invasion of SGC-7901 cells(±s，n=6)

＊P＜0.05 compared with blank control.

groups cell count blank control 149±19 Y-27632 56±17*siRNA-SRF-1107 56±15*

图1 Y-27632对SGC-7901细胞系侵袭能力和迁移能力的影响Fig1 The effect of Y-27632 on invasion and motility of SGC-7901 cells (×100)

2.3 Western blot检测ROCK1、SRF、E-cadherin、F-actin、MRTF-A、β-catenin 和Cycling D1的表达

用20 μmol/L Y-27632 能显著下调胃癌SGC-7901细胞的ROCK1表达，相对表达量为对照组的37.0 %(P＜0.05)(图2，表4)。

图2 Y-27632和siRNA-SRF 对SGC-7901细胞系ROCK1 和SRF表达的影响Fig2 The effect of Y-27632 and siRNA-SRF on ROCK1 and SRF expressions in SGC-7901 cells

表4 Y-27632和siRNA-SRF 对SGC-7901细胞系ROCK1、SRF、E-cadherin、F-actin、MRTF-A、β-catenin和Cyclin D1表达的影响Table4 The effect of Y-27632 and siRNA-SRF on ROCK1，SRF，E-cadherin，F-actin，MRTF-A，β-catenin and Cyclin D1 expressions in SGC-7901 cells(±s，n=6)

表4 Y-27632和siRNA-SRF 对SGC-7901细胞系ROCK1、SRF、E-cadherin、F-actin、MRTF-A、β-catenin和Cyclin D1表达的影响Table4 The effect of Y-27632 and siRNA-SRF on ROCK1，SRF，E-cadherin，F-actin，MRTF-A，β-catenin and Cyclin D1 expressions in SGC-7901 cells(±s，n=6)

＊P＜0.05 compared with blank control.

group ROCK1 SRF E-cadherin F-actin MRTF-A β-catenin Cycling D1 blank control 0.99±0.04 1.00±0.07 0.96±0.05 1.02±0.12 1.06±0.06 1.02±0.02 0.99±0.07 Y-27632 0.37±0.01* 0.63±0.06* 2.64±0.63* 0.64±0.09* 0.47±0.15* 1.04±0.12 0.98±0.18 siRNA-SRF-1107 0.92±0.09 0.37±0.10* 2.74±0.35* 0.65±0.03* 0.54±0.20* 0.61±0.07* 0.47±0.13*

Y-27632 能显著下调胃癌SGC-9701细胞SRF蛋白的表达，相对表达量为对照组的62.7%(P＜0.05);siRNA-SRF 转染组中SRF的相对表达量为对照组的36.9%(P＜0.05)。而Y-27632 干预组SRF的相对表达量高于siRNA转染组(P＜0.05)。

应用20 μmol/L Y-27632 能够显著上调E-cadherin的表达，是对照组的2.64倍(P＜0.05)。siRNA-SRF 转染组也具有类似效应(图3，表4)。

与相应对照组相比Y-27632 能够显著下调F-actin和MRTF-A的表达(P＜0.05)。siRNA-SRF转染组也具有类似效应(图3，表4)。

应用siRNA-SRF 能显著抑制β-catenin的表达，其相对表达量为对照组的61.0%(P＜0.05)。同时siRNA-SRF 能够显著下调胃癌SGC-9701细胞Cyclin D1蛋白的表达，其相对表达量是空白对照组的47.3%(P＜0.05)(图4，表4)。

图3 Y-27632和siRNA-SRF 对SGC-7901细胞系E-cadherin，F-actin 和MRTF-A表达的影响Fig3 The effect of Y-27632 and siRNA-SRF on E-cadherin，F-actin and MRTF-A expressions in SGC-7901 cells

图4 Y-27632和siRNA-SRF 对SGC-7901细胞系β-catenin 和cyclin D1表达的影响Fig4 The effect of Y-27632 and siRNA-SRF on non-phospho β-catenin and cyclin D1 expressions in SGC-7901 cells

3 讨论

血清应答因子是属于MADS 盒家族的转录因子，能够参与调控细胞增殖、分化和凋亡等多种细胞进程。研究表明SRF是调控细胞分化和细胞周期的重要转录因子[4-8]，SRF 能够通过调控E-cadherin/β-catenin 复合物来促进肿瘤的增殖和转移。本研究发现基因沉默SRF 能够上调E-cadherin的表达，同时下调β-catenin的表达。上调E-cadherin的表达，使细胞运动性减弱，相应其侵袭和迁移能力被阻遏。Wnt/β-catenin信号能够激活下游靶基因的转录活性，促进细胞增殖和分化[9-10]。本研究还发现，β-catenin 下调，伴随Cyclin D1表达的下调，使细胞周期停滞于G1期，细胞增殖受抑。因此，SRF 可能是通过调节E-cadherin/β-catenin的表达，从而调控胃癌SGC-7901细胞的迁移能力和增殖能力，基因沉默SRF 能够显著抑制胃癌SGC-7901细胞的增殖，并抑制其侵袭和迁移的能力。

RhoA 信号通路是激活核内SRF表达的重要信号传导通路之一，能够促进生长相关基因和细胞周期基因的转录。SRF 自身转录活性相对较低，需与辅因子结合后发挥调控靶基因的作用。myocardin转录因子(myocardin-related transcription factors，MRTF)是SRF 重要的辅因子之一，包括MRTF-A，也被称为心肌样蛋白1 (myocardin-like protein 1，MKL1)和MRTF-B(也被称为MKL2)。研究表明Rho 信号传导通路能够激活MRTF 信号，活化的Rho 激活下游效应因子如ROCK，促进细胞内肌动蛋白丝形成，使球状肌动蛋白(G-actin)聚合成为(纤)丝状肌动蛋白F-actin，同时G-actin 与MRTF-A(MAL)解聚，MRTF-A(MAL)转位入核，激活SRF 依赖的转录[1-3]。Y-27632是ROCK 特异性通路阻断剂。近来研究发现Y-27632 具有抑制肿瘤细胞迁移和侵袭的效应。本研究发现，Y-27632 能够抑制胃癌SGC-7901细胞系的侵袭能力和迁移能力，Transwell 小室和划痕实验都显示应用20 μmol/L的Y-27632后，与空白对照组相比，细胞穿透matrigel基底膜的数目减少，提示其侵袭能力减弱;划痕实验提示Y-27632 能够显著抑制胃癌SGC-7901细胞的迁移能力。由于Y-27632是ROCK 特异性通路阻断剂，因此Y-27632对肿瘤细胞的这种抑制侵袭和迁移能力可能与Rho 信号通路相关。本研究还显示，应用Y-27632 仅对胃癌SGC-7901细胞侵袭和迁移能力具有抑制作用，而对细胞增殖无影响，然而基因沉默SRF 细胞增殖显著受限，提示Y-27632 可能部分影响或抑制SRF 转录活性，或者说并不是通过直接抑制SRF的表达而发挥作用的。本研究表明，E-cadherin通过β-catenin 与细胞骨架结合，能够促进同型细胞之间的黏附，使上皮细胞保持紧密连接。近来研究表明，E-cadherin表达的下调能够激活MRTF-A(MAL)/SRF 信号，促进SRF的转录，使肿瘤细胞获得间质表型[11-12]。而这种由E-cadherin 下调介导SRF的激活可以受到RhoA/ROCK 和其他信号传导通路的调控[13-14]。Y-27632 能够上调E-cadherin的表达，同时阻断ROCK信号能够抑制G-actin聚合为F-actin，相应抑制G-actin 与MRTF-A的解离，表现在Y-27632 干预组MRTF-A表达水平下调。而SRF 自身转录活性较低，缺乏辅因子MRTF-A的协同作用，最终导致SRF 转录水平的下调，产生与siRNA-SRF 相类似的结果。说明Y-27632 可能并不是通过直接抑制SRF的转录，而是通过抑制辅因子MRTF-A的表达下调SRF 转录水平，从而实现抑制胃癌SGC-7901细胞系侵袭和迁移能力的效应。

综上所述，SRF 通过调节E-cadherin/β-catenin的表达，增强胃癌SGC-7901细胞的迁移、侵袭和增殖能力。Y-27632 能够上调E-cadherin的表达，同时阻断ROCK信号抑制SRF 辅因子MRTF-A的表达，进而下调SRF 转录水平，发挥其拮抗胃癌SGC-7901细胞的迁移和侵袭的作用。

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