恒河猴BST-2基因编码区单核苷酸多态性及其对蛋白结构和功能的影响

董志会，王 卫，丛 喆，熊圣文，骆 杨，陈 霆，魏 强

(北京协和医学院比较医学中心，中国医学科学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021）

恒河猴BST-2基因编码区单核苷酸多态性及其对蛋白结构和功能的影响

董志会，王 卫，丛 喆，熊圣文，骆 杨，陈 霆，魏 强

(北京协和医学院比较医学中心，中国医学科学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021）

目的筛查恒河猴BST-2基因编码区单核苷酸多态性(coding－region single nucleotide polymorphism，cSNP），研究其对蛋白结构和功能的影响。方法提取恒河猴外周血RNA，RT－PCR扩增，单克隆测序比对，确定猴BST-2的cSNP位点;通过蛋白质结构分析软件对蛋白结构进行分析;比较不同基因型猴体内SHIVSF162p3复制水平的差异。结果 序列比对发现8个非同义突变位点;经Psipred软件预测，其中G41A、T128C、C129和A333C cSNP位点可影响BST－2蛋白二级结构。在SHIVSF162p3感染平台期，参考基因型猴(DLQ）病毒复制水平要高于GLQ型猴(P＜0．05），其他基因型猴之间无显著差异。结论 cSNP(G41A）可能影响BST－2的抗病毒功能，这为后续研究提供参考信息。

BST－2;cSNP;蛋白质结构;恒河猴

骨髓基质细胞抗原－2(bone marrow stromal cell antigen 2，BST－2），也称tetherin，CD317或MH1．24，是近年来新发现的包膜病毒限制因子之一［1－2］。BST－2是一种具有特殊拓扑结构的脂筏相关跨膜蛋白，其通过连接病毒和宿主细胞膜，将新出芽病毒束缚在细胞膜表面，从而限制病毒的释放［1］。有研究表明，其他天然抗病毒蛋白在与病毒协同进化的过程中，会出现某些位点核苷酸的突变，从而影响它们的抗病毒能力［1，3－4］;有文献报道，人BST-2基因部分氨基酸残基位点的改变可能影响HIV－1vpu对BST－2的敏感性［5］。但有关恒河猴BST-2基因多态性，及对蛋白结构和功能的影响尚未见报道。本研究旨在通过基因测序、序列比对、蛋白质结构预测等技术找到恒河猴BST-2基因中影响抗SIV功能的cSNP位点，以及比较不同基因型猴艾滋病病毒复制的峰值与控制值，从而为后面探究猴BST－2抗病毒作用提供一定理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物与样品采集

中国恒河猴55只，购自北京协尔鑫生物资源研究所【SCXK(京）2005－2005】;分别采集动物外周血1 mL，EDTA抗凝，样品采集后4 h内提取RNA。

1.2 实验动物病毒感染与指标测定

在实验55只猴中选取20只恒河猴采取静脉注射感染，感染病毒为SHIVSF162p3，毒力为300TCID50，在攻毒后3 d，7 d，10 d，后每隔7 d采集动物外周血1 mL，EDTA抗凝;样品采集后4 h内，分血浆，实时荧光定量PCR测血浆病毒载量，流式细胞术和血常规对全血进行分析。

1.3 外周血RNA的提取及反转录

实验猴EDTA抗凝全血使用RNA BLOOD MINI KIT(购自QIAGEN公司）进行总RNA的提取，提取过程参照试剂盒说明书;提取RNA后立即对其进行反转录。

1.4 RT-PCR扩增

BST-2基因扩增采用两步法，第一步使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，大连）进行RT－PCR合成cDNA第一条链，操作过程参照试剂盒说明书;第二步用高保真酶KOD－Plus试剂盒(TOYOBO，上海）扩增BST-2基因，操作过程参照试剂盒说明书。BST-2基因引物来自参考文献［6］，由 Invitrogene公司合成。引物序列为：F 5'－ATA ACT CGA GGT GGA ATT CAT GGC ACC TAT TTT GTA TGA C－3'，R 5'－ATA TTG GTA CCT CAC AGC AGC AGA GCG CTC AAG CCC AGC AGC AG－3'，退火温度63℃。PCR在System 9700 PCR仪上进行(Applied Biosystems公司）

1.5 单克隆分型检测

使用 QIAquick PCR Purification Kit(购自QIAGEN公司）对PCR产物进行纯化回收，纯化回收过程参照试剂盒说明书;对纯化回收回来的DNA片段用DNA A－Tailing Kit(TaKaRa，大连）进行加A尾，加A尾过程参照试剂盒说明书;对加完A尾的DNA片段回收，与pMDTM18－T Vector进行连接，连接步骤参照pMDTM18－T Vector Cloning Kit(TaKaRa，大连）说明书;对连接好后的质粒进行转化，感受态细胞为 E．coli JM109 Competent Cells(TaKaRa，大连），转化过程参考试剂盒说明书;转化好后的感受态细胞放于1 mL无抗生素的SOS培养基中，在摇床上37℃，180 r/min培养1 h，然后从1 mL的菌液中抽取300 uL平铺在带有氨苄抗性的平板上，37℃恒温培养16 h;待平板长出菌落，挑取菌落，进行菌落PCR，每个样品选取6个阳性菌，送诺塞(北京）公司测序。

1.6 序列比对和生物软件分析

DNA测序由北京诺赛基因公司完成。利用BioEdit软件进行核苷酸和氨基酸序列比对，恒河猴［Macaca mulatta］ BST-2参考 cDNA 序列为： Transcript_id="NM_001161666．1";恒河猴［Macaca mulatta］BST－2氨基酸参考序列为：Protein_id="NP _001155138．1"。分别用 Psipred软件，SWISSMODEL软件进行蛋白质二级和三级结构的预测。

2 结果

2.1 中国恒河猴BST-2基因编码区cSNP位点的分布

提取20只恒河猴全血RNA，逆转录PCR后进行测序比对(参照序列为 NCBI上公布的 BST－2 cDNA序列，NM_001161666），一共找到9个突变位点，分别位于基因的胞质区、跨膜区和胞外区(表1）;通过使用BioEdit软件进行翻译和氨基酸序列比对，发现其中8个突变位点为非同义突变，在BST－2蛋白一级结构上的位置分别是：9(C/G），12(P/ S），14(D/G），29(I/V），43(L/P），111(Q/H），159(P/S）(图1）。其中G9R，P12S，D14G分布在BST－2的胞质区;I29V，L43P分布在BST－2的跨膜区上;Q111H，P159S分布在BST－2的胞外区上。

图1 恒河猴BST－2的蛋白质结构及SNP分布情况Fig．1 Protein structure and SNP distribution in BST－2 of rhesus macaques

表1 恒河猴BST-2基因突变位点Tab．1 Nucleotide mutants of rhesus macaques

2.2 非同义cSNP对BST-2蛋白二级结构的影响

Psipred软件分析结果显示，3个非同义cSNP位点突变影响了BST－2蛋白的二级结构，具体分析，在13～15氨基酸残基位置由一个无规则卷曲变成α螺旋，40～42氨基酸残基由α螺旋转变为无规则卷曲，111氨基酸残基从原来的α螺旋转变成无规则卷曲，其它结构均未发生变化(图2）。

2.3 基因分型及cSNP位点的频率测定

通过单克隆测序，用BioEdit软件比对发现55只中国恒河猴中G41A基因频率占2．17%;T128C的基因频率为 22．5%;C129G的基因频率为50%;A333C的基因频率为5%。对基因分型结果进行分析，共找到了6种主要基因型(自然存在的）(表2）。

图2 BST-2基因cSNP引起的蛋白二级结构变化Fig．2 The change of secondary structure caused by cSNP of BST-2

表2 恒河猴BST-2基因型及比率Tab．2 Genotypes of rhesus macaques’BST-2

2.4 不同基因型对猴艾滋病疾病进程的影响

经过对不同基因型猴BST－2蛋白的二级结构预测，我们对这20只猴进行了基因型的分类，共分成了5群，分别是GLP(4只），DLQ(5只），DLQ/DPQ (4只），DLQ/GLQ(5只），DPH/DPQ(2只）。G/D是第14位氨基酸残基类型，L/P是第43位氨基酸残基类型，Q/H第111位氨基酸残基类型。在这里，我们对不同基因型猴感染SHIVSF162p3之后病毒复制峰值和病毒复制控制值做了统计分析，统计方法采用单因素方差分析，通过Student－Newman－Keuls检测，进行两两比较，以P＜0．05为差异具有统计学意义。从图中我们可以看出，除了在病毒复制控制值上，DLQ型基因猴组高于GLQ型猴组有统计学差异外(P＜0．05），其他基因型猴组在病毒复制峰值和病毒控制值上两两之间均无统计学差异。具体来说，GLQ型与DLQ相比，DLQ型组峰值要高于GLQ;比较DLQ型和DLQ/DPQ型，DLQ组峰值和控制值要高于 DLQ/DPQ组;比较 DLQ/DPQ型和DPH/DPQ型，DLQ/DPQ型组与DPH/DPQ型组峰值差异不明显，DLQ/DPQ组控制值要略高于DLQ/ DPQ组(图3）。

图3 不同BST-2基因型的病毒复制峰值和控制值Fig．3 The replication peak value and set－point value of different BST-2 genotype

3 讨论

BST－2主要在未分化的B细胞，骨髓基质细胞，树突状细胞等多种细胞中表达是一种典型的II型跨膜蛋白［7］。BST－2氨基端位于胞质内，随后是一个α螺旋结构的跨膜蛋白域，胞外区也呈α螺旋结构，其羧基端有一个糖基磷脂酰肌醇锚定点［5］。BST－2不仅可以抑制免疫缺陷病毒的释放，还可以抑制多重包膜病毒的释放［7－8］，由此，我们可以看出BST－2具有广泛的的抗包膜病毒释放作用，因此，BST－2抗病毒的作用不可能是与病毒特异性的结合，2009年，Perez－Caballero年发现与BST－2具有相似拓扑结构的二聚体分子同样具有束缚HIV－1的作用，表明是BST－2的拓扑结构而不是其一级结构氨基酸的序列起抗病毒作用［9］。现在，人们普遍认为，BST－2作为一个桥梁连接宿主细胞和病毒，从而把病毒粘连在宿主细胞表面，进而把一部分病毒内吞降解。研究发现，不同病毒对BST－2的抗病毒作用有拮抗作用，如HIV－1vpu可以与人BST－2的跨膜区结合，从而诱导BST－2膜定位的转移及降解［1］; SIV nef蛋白可以与猴BST－2的胞质区氨基酸残基结合，诱导降解BST－2［10］。比较人与恒河猴的BST－2蛋白一级结构，发现人BST－2胞质区比猴的BST－2蛋白胞质区少了5个氨基酸残基，而这5个氨基酸残基正是 SIVnef与猴 BST－2相互作用的关键部位［11］。Marina Laplana 2013年发现，不同的人BST－2基因型对艾滋病疾病进程具有一定的影响［12］。因此，有可能不同猴BST-2基因型对猴艾滋病疾病进展有影响。

由cSNP碱基序列的不同而产生的非同义突变会造成蛋白质一级结构的变化，从而影响蛋白的高级结构。这种改变常常造成蛋白质一些功能的变化。本研究主要找出猴BST-2非同义cSNP碱基序列的改变，通过蛋白二级结构预测和结合猴艾滋病疾病进程来分析这些 cSNP对猴 BST－2功能的影响。

在这里，我们发现了八个非同义cSNP位点，用Psipred软件分析显示，只有三个cSNP位点的改变对猴BST－2的二级结构产生了影响，尤其是第14为G/D的变化使得猴BST－2胞质区的一小段α螺旋得以延伸，而第14，15，16，17，18，19位这几个氨基酸残基正是SIV nef的结合关键位点，而其他两个cSNP位点的改变虽对BST－2的二级结构产生了一些变化，但是用SWISS－MODEL软件分析发现，这两个cSNP对猴BST－2的三级结构几乎没有影响，而且在BST－2是以其独特的拓扑结构来发挥其抗病毒作用，因此这两个cSNP对BST－2的功能可能不会有太大影响。在不同基因型猴艾滋病疾病进程的比较中，DLQ型峰值和控制值要高于GLQ型，DLQ型峰值和控制值要高于DLQ/DPQ型，DLQ/DPQ型与DPH/DPQ型峰值差异不明显，DLQ/DPQ型控制值要略高于DLQ/DPQ型，这些说明了猴BST－2蛋白在第14位，第43位氨基酸残基分别是G和P时，有可能可以增强其抗病毒作用，而111位氨基酸残基的变化可能对猴BST－2抗病毒作用并无影响。在这里我们需要提出的是，艾滋病是一个极其复杂的病毒感染性疾病，有很多因素影响着其疾病进程，因此，我们还需要进一步实验验证这些位点与猴BST－2蛋白抗病毒作用有关。

本实验为进一步研究猴BST－2蛋白功能提供一定参考依据，为病毒拮抗该蛋白的机制研究提供参考。下一步，我们将在细胞实验上去验证这3个cSNP位点对猴BST－2抗病毒作用的影响。

［1］STUART J N，ZANG T，BIENIASZ P D．Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV－1 Vpu［J］．Nature，2008，451(7177）：425－430．

［2］VAN DAMME N，GOFF D，KATSURA C，et al．The interferoninduced protein BST－2 restricts HIV－1 release and is downregulated from the cell surface by the viral Vpu protein［J］．Cell Host Microbe，2008，3(4）：245－252．

［3］ MCEWAN WA，SCHALLER T，YLINEN LM，et al．Truncation of TRIM5 in the feliformia explains the absence of retroviral restriction in cells of the domestic cat［J］．Virol，2009，83 (16）：8270－8275．

［4］ ROLLASON R，KOROLCHUK V，HAMILTON C，et al．Clathrin－mediated endocytosis of a lipid－raft－associated protein is mediated through a dual tyrosine motif［J］．Cell Sci，2007，120 (Pt 21）：3850－3858．

［5］KUPZIG S，KOROLCHUK V，ROLLASON R，et al．Bst－2/ HM1．24 is a raft－associated apical membrane protein with an unusual topology［J］．Traffic，2003，4(10）：694－709．

［6］YOSHIDA T，KAO S，STREBEL K．Identification of residues in the BST－2 TM domain important for antagonism by HIV－1 VPU using a Gain－of－Function approach［J］．Front Microbiol，2011，2：35．

［7］ISHIKAWA J，KAISHO T，TOMIZAWA H，et al．Molecular cloning and chromosomal mapping of a bone marrow stromal cell surface gene，BST2，that May be involved in pre－B－cell growth［J］．Genomics，1995，26(3）：527－534．

［8］JOUVENET N，NEIL SJ，ZHADINA M，et al．Broad－spectrum inhibition of retroviral and filoviral particle release by tetherin［J］．J Virol，2009，83(4）：1837－1844．

［9］PEREZ－CABALLERO D，ZANG T，EBRAHIMI A，et al．Tetherin inhibits HIV－1 release by directly tethering virions to cells［J］．Cell，2009，139(3）：499－511．

［10］ZHANG F，WILSON SJ，LANDFORD WC，et al．Nef proteins from simian immunodeficiency viruses are tetherin antagonists［J］．Cell Host Microbe，2009，6(1）：54－67．

［11］ EVANS DT，SERRA－MORENO R，SINGH RK，et al．BST－2/ tetherin：a new component of the innate immune response to enveloped viruses［J］．Trends Microbiol，2010，18(9）：388－396．

［12］LAPLANA M，CARUZ A，PINEDA JA，et al．Association of BST－2 gene variants with HIV disease progression underscores the role of BST－2 in HIV type 1 infection［J］．Infect Dis，2013，207(3）：411－419．

Polymorphisms of coding region in BST-2 gene of Rhesus macaques and their effects on protein structure and function

DONG Zhi－hui，WANG Wei，CONG Zhe，XIONG Sheng－wen，LUO Yang，CHENG Ting，WEI Qiang
(Comparative Medicine Center，Peking Union Medical College(PUMC）＆Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences(CAMS）;Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health; Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State administration of Traditional Chinese medicine，Beijing 100021，China）

Objective To explore the impacts of cSNP on the structure and function of rhesus macaque’s BST－2．Methods Extracting RNA from peripheral blood of rhesus macaques，then RT－PCR，Monoclonal sequencing to find the cSNP sites;Forecasting the structure of these proteins;Comparing the Level of SIVmac239 replication between the different genotypic Rhesus macaques．Results We found 8 non－synonymous mutation sites，in the 8 non－synonymous mutation sites，Only G41A，T128C，C129 and A333C change the secondary protein structure of BST－2 by forecasting of Psipred software;At the plateau of SHIVSF162p3 replication，The SHIVSF162p3 replication level of reference genotype rhesus macaque(DLQ）is higher than rhesus macaques of GLQ genotype，other genotypes rhesus macaques have no significant difference．Conclusion cSNP(G41A）may influence the antiviral activity of rhesus macaque’s BST－2，this study gives us a reference to further research work．

BST－2;cSNP;Structure;Rhesus macaque

魏强(1964－），男，教授，博士生导师，研究方向：实验动物病毒学。E－mail：weiqiang0430@sohu．com。

R－332

A

1671－7856(2015）07－0020－05

10．3969．j．issn．1671．7856．2015．007．005

“十二五”传染病重大专项课题(2012ZX10004－501－001;2013ZX10004－608－003）

董志会(1988－），男，硕士生，专业：比较医学。

2015－06－10