SiRNA干扰慢性炎性痛大鼠患侧背根神经节MrgC表达及PKCε磷酸化的研究

林小溪，方 芳，方剑乔，刘盈君

(浙江中医药大学第三临床医学院，杭州 310053）

SiRNA干扰慢性炎性痛大鼠患侧背根神经节MrgC表达及PKCε磷酸化的研究

林小溪，方 芳，方剑乔，刘盈君

(浙江中医药大学第三临床医学院，杭州 310053）

目的 观察鞘内注射小干扰 RNA(small interference RNA，siRNA）对完全弗氏佐剂(complete freund’s adjuvant，CFA）诱导的慢性炎性痛大鼠患侧背根神经节(dorsal root ganglion，DRG）中MrgC(Mas－related G protein－coupled receptor C，MrgC）mRNA与蛋白表达的干扰作用，并观察该作用对大鼠患足痛阈及患侧DRG PKCε丝氨酸729点位磷酸化 (phosphorylation of PKCε Ser729，p－PKCε Ser729）水平的影响。方法健康雄性 SD (Sprague－Dawley，SD）大鼠16只，随机分为对照siRNA组，MrgC siRNA组，每组8只。大鼠脊髓鞘内插管成功后，两组大鼠给予相应药物鞘内注射4 d，1次/d，5 μg/d/只。给药第4 d，大鼠右后足底注射CFA 0．1 mL建立慢性炎性痛模型，此后隔日注射药物，直至给药第11 d处死。分别于鞘内置管前、给药前、给药4 d(CFA造模0 h）、给药5 d (CFA造模24 h）、给药11 d(CFA造模7 d）5个时点检测大鼠患足机械缩腿阈(Paw withdrawal thresholds，PWTs）的变化。荧光定量PCR法检测患侧DRG MrgC的mRNA的表达，免疫荧光法检测患侧DRG MrgC表达量及p－PKCε Ser729的含量。结果 与给药4 d比较，给药5 d两组大鼠的PWTs均有显著的下降(P＜0．01）;给药前后各时点，两组大鼠之间PWTs没有明显差异。观察给药11d时大鼠患侧L4－L6 DRG MrgC mRNA的表达，与对照siRNA组比较，MrgC siRNA组各神经节MrgC mRNA的表达均明显下降(P＜0．01）;观察大鼠给药11d时大鼠患侧L4－L6 DRG MrgC与p－PKCε Ser729的表达，与对照siRNA组比较，MrgC siRNA组患侧DRG的MrgC阳性细胞率明显减少(P＜0．01），而p－PKCε Ser729的阳性细胞率显著上升(P＜0．05）。结论 MrgC siRNA片段可有效干扰CFA慢性炎性痛大鼠患侧L4－L6 DRG MrgC mRNA与MrgC的表达，对MrgC的干扰作用能显著上调PKCε Ser729磷酸化的水平，但不影响大鼠患足机械缩腿阈。

小干扰RNA;MrgC;蛋白激酶C ε亚基Ser729磷酸化;慢性炎性痛;背根神经节

慢性炎性疼痛广泛地存在于各种疾病的进程中，目前抑制疼痛的药物阿片受体激动剂吗啡与炎性介质抑制剂的临床疗效都不佳，而慢性疼痛相关的外周细胞与分子功能研究成为镇痛研究的重要方向。

2001年发现的 MrgC(Mas－related G proteincoupled receptor C，MrgC）是一种新型的G蛋白偶联受体，其基因仅在外周神经系统中与痛觉调制有密切联系的背根神经节(dorsal root ganglion，DRG）和三叉神经节的中小型感觉神经元高度表达［1－2］。研究证实MrgC参与慢性炎症引发的外周痛觉过敏的调制，但其机制远未阐明，且目前尚未有MrgC特异性抑制剂供进一步深入研究。

细胞内信号转导分子蛋白激酶C(protein kinase C，PKC）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶［3］。其亚基PKCε在慢性疼痛外周痛觉敏化的形成中起着关键性作用［4］。PKCε磷酸化是其功能被激活的重要标志［2，5］。研究表明MrgC的调制作用与PKC密切相关［6］，因此本实验拟建立完全弗氏佐剂(complete freund’s adjuvant，CFA）慢性炎性痛模型，鞘内注射MrgC小干扰RNA(small interference RNA，siRNA），观察该片段对大鼠患侧L4－L6 DRG MrgC mRNA和受体表达的沉默作用及其对PKCε丝氨酸729点位磷酸化(phosphorylation of PKCε Ser729，p－PKCε Ser729）水平和机械痛的影响，为后续MrgC生理药理功能的深入研究打下基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

选用清洁级健康雄性SD大鼠16只，体重280～300 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司【SCXK (沪）2013－0016】，由浙江中医药大学实验动物中心饲养【SYXK(浙）2013－0184】，饲养期间给予啮齿动物标准颗粒饲料及自由饮水，12 h循环灯光，室温23±2℃。

1.2 主要实验试剂和仪器

MrgC抗体(批号：0121212030827，美国Abnova有限公司）;CFA(批号：051M8725，美国 Sigma公司）;山羊血清封闭液(批次：140214;BIOSS公司）;多聚赖氨酸处理载玻片(南通天盛实验器材有限公司）;MrgC siRNA与对照 siRNA(批号：3360;life technologies公 司）;Goatanti－rabbitIgG(批 号： A120101F13;美国 Abnova有限公司）;Anti－PKCε (phospho S729）antibody(批号F1510;美国Abnova有限公司）;抗荧光淬灭 PVP封片液(产品编号： p0128;碧云天生物技术研究所）;Trizol：(批号： 28218;life technologies公司）逆转录试剂盒(批号： RR047A，大连宝生物公司）;PCR试剂盒(批号： 1725201AP;美国Bio－Rad公司）。其他试剂均为国产分析纯。

Thermo冰冻切片机(型号：HM550，美国Thermo Scientific公司）;激光共聚焦显微镜(型号： AIR;日本尼康公司）;紫外分光光度计(型号： smartspecTMplus，BIO－RAD公司）;荧光定量PCR仪(型号：CFX96TMReal－Time system，BIO－RAD公司）;逆转录仪(S1000TMThermal cycler，BIO－RAD公司）; PE导管(型号：PE－10，OD 0．5 mm，ID 0．25 mm;公司：宁波市科技园区安来软件科技有限公司）。

1.3 实验动物模型制备

1．3．1 脊髓鞘内置管模型［7－10］

大鼠禁食1 d后，水合氯醛350 mg/kg麻醉，剃除腰背部鼠毛，酒精消毒，切开皮肤，分离肌肉，暴露L5棘突，用咬骨钳扳掉棘突，将PE－10聚乙烯管插入脊髓蛛网膜下腔，从L5向L2缓缓进管约3．5 cm。见有脑脊液流出后，即封住外口，缝合肌肉和皮肤，并将PE－10管固定于浅层肌肉上。术后恢复3 d后，鞘内给予10 μL盐酸利多卡因，选取在30 s内双下肢瘫痪，5～10 min内恢复正常的大鼠进行后续试验。

1．3．2 CFA慢性炎性痛模型

从大鼠右后足垫部向踝关节方向注入 CFA (0．1 mL/只），4 h后注射关节局部出现炎症反应，并出现痛觉过敏，大鼠致炎关节肿胀疼痛可持续4周以上［11］。

1.4 实验动物分组与处理

1．4．1 实验动物分组

大鼠行鞘内置管术后恢复5 d，检测大鼠患侧足缩腿阈，随机分为两组，对照 siRNA组和 MrgC siRNA组，每组8只。

1．4．2 药物配制与实验动物处理

1．4．2．1 药物配制

MrgC siRNA序列为［12］5'－CAUGUCAGCUAU UAUAUGUt－ps－t－3'和 3'－t－ps－t GUACAGUCGAUAA UAUACA－5';错 位 对 照 siRNA 序 列 为 5' CAAGUUAUC UAGUAAUUAUa－ps－t－3和 3'－t－ps－a GUU CAA UAG AUC AUU AAU A－5'。序列中的“t”代表2－O－甲基尿嘧啶核苷;“a”代表2'－O－甲基腺嘌呤;“ps”代表硫代磷酸键。均为life technologies公司制备。将siRNA 50 μg加入DEPC水43．3 μL配置成100 μm siRNA溶液，将siRNA加入216．5 μL的I－fectTM转染试剂中，用枪头轻轻搅拌，使之均匀，在室温放置5 min，使siRNA和转染试剂充分反应成有效的转染试剂siRNA复合物。

1．4．2．2 实验动物处理

两组大鼠CFA造模前分别给予4 d不同药物：对照siRNA组给予对照siRNA和MrgC siRNA组给予MrgC siRNA，第4天药后CFA造模，造模后隔日注射相应药物3次，剂量均为5 μg/d/10μL。

于鞘内置管前、给药前、给药4 d(CFA造模0 h）、给药5 d(CFA造模24 h）、给药11 d(CFA造模7 d）共计5个时点检测大鼠患侧足缩腿阈。

1.5 样本制备

大鼠行腹腔水合氯醛350 mg/kg麻醉，用于免疫荧光检测的大鼠生理盐水经心灌注后，再用4%多聚甲醛滴注，快速取得患侧L4－L6 DRG，用4%多聚甲醛溶液固定4 h，蔗糖溶液梯度脱水(15%蔗糖溶液24 h，30%蔗糖溶液48 h），经液氮速冻，放入－80℃冰箱中保存备用。用于PCR的大鼠仅灌注生理盐水，冰上取患侧L4－L6 DRG，立即置于－80℃冰箱中保存备用。

1.6 指标检测

1．6．1 足缩腿阈(paw withdrawal thresholds，PWTs）

以患侧PWTs作为机械痛敏的评定值：测量前，将大鼠放置于透明塑料盒(69 cm×17 cm×14 cm）中适应15 min。待大鼠安静后，将类似Von Frey丝的金属丝(φ0．5 mm）置于大鼠足底正中(避开足垫），从0开始以2．5 g/s递增的强度刺激大鼠足底，直至引发大鼠缩足反射，记录此时刺激强度，连续测量3次，每次间隔5 min，取平均值作为测定结果。设定最大刺激强度为50 g，截止时间为20 s，以免大鼠足爪损伤。

1．6．2 大鼠患侧L4－L6 DRG中的MrgC mRNA的表达

总RNA的提取：取出大鼠L4－L6 DRG，加入1 mL Trizol，冰上超声粉碎，室温静置5 min，加入200 μL氯仿，混匀后剧烈震荡，静置15 min，4℃，11，440 r/min离心15 min，取上清液再加入500 μL异丙醇，混匀后4℃，11，440 r/min离心10 min，取沉淀加入75%乙醇1mL，用移液枪进行轻轻吹打，4℃，10，444 r/min离心5 min，待RNA沉淀干燥后，加入0．1% DEPC水溶解。紫外分光光度法检测 OD260/ OD280的比值，并计算其浓度。取该比值在1．8～2．0之间的RNA溶液进行后续实验

逆转录：采用含DNA酶消化步骤的Takara的逆转录试剂盒，按说明书操作，合成cDNA：吸取2 μL总RNA溶液、随机引物、RTmix(含RNAsin和DTT）、dNTP混合液、DEPC水按照逆转录体系比例配制反应体系。

定量PCR：采用 PRIMER5．0软件设计引物，MrgC上游引物：5'－ACTCTGGCTCTTGGGATT－3'，下游引物：5'－GAGGGACCGATGCTTTT－3';采用糖酵解反应中的甘油三磷酸脱氢酶(glyceraldehydephosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参［13］，其上游引物：5'－TGCTGAGTATGTCG TGGAG－3'，下游引物：5'－GTCTTCTGAGTGGCAGTG AT－3'，均由上海生工生物技术有限公司合成。参照BIORAD试剂盒，以cDNA为模板，GAPDH为内参，采用SYBR Green法在20 μL反应体系中扩增cDNA样品。MrgC与GAPDH的反应条件为：95℃30 s，然后95℃5 s，56℃30 s，共39循环。设置溶解曲线检测产物反应的纯度65℃ ～95℃5 s，0．5℃步进。每次扩增的同时设置无cDNA的阴性对照，每个样本设3个复孔。采用2－△CT法进行计算，结果以对照siRNA组基因表达量的倍率表示。

1．6．3 大鼠患侧L4－L6 DRG中MrgC和p－PKCε的阳性细胞率的检测

采用贴片法，DRG冰冻切片(14 μm），贴于载玻片上，室温晾干1 h。用组化油笔将待染组织圈好，1%PBS浸洗4次，每次10 min。取出玻片，滴加10%山羊血清(1%PBS稀释）37℃孵育1 h。弃山羊血清，加入 MrgC抗体(1∶100）(p－PKCε(1∶2000）），置湿盒中4℃过夜。次日拿出湿盒，放于37℃孵育45 min，弃一抗，1%PBS浸洗4次，每次10 min。滴加羊抗兔IgG(1∶1000）(羊抗小鼠IgG(1∶1000））进行荧光标记，37℃避光孵育1 h。弃二抗，1%PBS浸洗4次每次10 min(避光）。晾干后滴加抗荧光淬灭封片液封片。设立阴性对照：采用不含一抗的稀释液替代一抗，其余条件不变。激光共聚焦显微镜下观察并拍片。以阴性对照为参考，用Ipp 6．0软件进行细胞计数，计算患侧L4－L6 DRG中总细胞数及阳性细胞数，并计算MrgC与p－PKCε阳性细胞的表达率。

1.7 统计结果

2 结果

2.1 鞘内注射siRNA对CFA大鼠PWTs的影响

笔者分别检测了鞘内置管前、给药前、给药4 d (CFA造模0 h）、给药5 d(CFA造模24 h）、给药11 d(CFA造模7 d）共计5个时点的大鼠患侧PWTs，来评价大鼠机械痛阈，将给药前的痛阈作为基础痛阈。

如图1所示，鞘内置管术前、给药前两组大鼠之间患侧后足PWTs没有明显差异(P＞0．05）。给药4 d后于大鼠CFA造模前(CFA造模0 h）检测两组PWTs，MrgC siRNA组的足缩腿阈较对照siRNA组有所上升，但其差异无统计学意义(P＞0．05）。给药5 d(CFA造模后24 h）时，可见两组PWTs较给药4 d(CFA造模0 h）均明显下降(P＜0．01），MrgC siRNA组的PWTs高于对照siRNA组，两组间差异仍无统计学意义(P＞0．05）。此趋势一直持续到给药第11天，两组的PWTs均低于给药4 d(CFA造模0 h）的 PWTs，但两组之间并无明显差异(P＞0．05）。

图1 两组大鼠在各时点PWTs变化情况Note：Compared with control siRNA group，＊＊P＞0．05;4d VS 5d，△△P＜0．01．Fig．1 The PWTs of two groups at different time points

2.2 鞘内注射MrgC siRNA对大鼠患侧L4-L6 DRG中MrgC mRNA表达的影响

分别检测给药11 d后两组大鼠患侧腰神经节L4、L5、L6的MrgC mRNA的表达量，以对照siRNA组表达量的倍数作图，结果见下图2。如图中所示，MrgC siRNA组患侧L4、L5、L6的MrgC mRNA表达量均低于对照siRNA组对应神经节的表达量(P＜0．01，P＜0．01，P＜0．01），分别为对照siRNA组表达量的0．71、0．67、0．71倍。

图2 两组大鼠患侧L4－L6 DRG MrgC的mRNA表达量的变化Note：compared with control siRNA group，＊＊P＜0．01．Fig．2 Comparison of the expression of MrgC mRNA in ipsilateral DRG L4－L6 between two groups

2.3 鞘内注射MrgC siRNA对大鼠患侧L4-L6 DRG中MrgC受体表达的影响

如图3中所示，MrgC主要表达在DRG的中小神经元中。分别检测给药11d后两组的MrgC表达变化，与对照siRNA组比较，MrgC siRNA组的MrgC阳性细胞率明显降低(P＜0．01），约为对照siRNA组的60%。荧光结果见彩插7图5。

图3 两组大鼠患侧L4－L6 DRG MrgC阳性细胞率的比较Note：compared with control siRNA group，＊＊P＜0．01．Fig．3 Rate of the expression of MrgC cells in L4－L6 ipsilateral DRG in each group

2.4 鞘内注射MrgC siRNA对大鼠患侧L4-L6 DRG中p-PKCε阳性细胞率的影响

检测给药11 d后L4－L6 DRG PKCε Ser729点位磷酸化的变化，以 p－PKCε的阳性细胞率来评价。结果如图4，与对照siRNA组比较，MrgC siRNA组的p－PKCε阳性细胞率明显升高(P＜0．05），约为对照siRNA组的126%。荧光结果见彩插7图6。

图4 两组大鼠患侧DRG p－PKCε阳性细胞率的比较Note：compared with control siRNA group，*P＜0．05．Fig．4 Rate of the expression of p－PKC in ipsilateral DRG of each group

3 讨论

MrgC是2001年发现的一类新型的G蛋白偶联受体，其基因仅仅高度表达于外周神经系统的DRG和三叉神经节的中小型感觉神经元中。研究发现MrgC参与慢性炎症引发的外周痛觉过敏的调制［14］。但由于目前尚未发现MrgC特异性抑制剂，未有直接的证据证实MrgC在慢性炎性痛发展过程中对疼痛的调制作用，进一步的功能研究只能通过siRNA干扰mRNA表达或基因敲除。siRNA干扰是指内源性或外源性小片段双链RNA与靶基因的mRNA同源互补，在细胞内特异降解靶mRNA，从而特异性封闭靶基因的过程［15］。研究报道，脊髓鞘内给予siRNA能够通过转染脊髓背角浅层的初级传入神经纤维逆行至DRG发挥其干扰作用［16］。本实验研究通过鞘内给予siRNA，观察到给药11 d时即CFA造模后第7天，MrgC siRNA组别DRG L4－L6的MrgC mRNA的表达量均明显低于对照siRNA组相应神经节的表达量，进一步观察发现MrgC siRNA组MrgC的表达明显降低，约为对照siRNA组的60%，与MrgC mRNA变化相一致。这说明鞘内注射该siRNA片段有效的抑制MrgC基因及其蛋白的表达，从而在CFA慢性炎性痛的基础上成功建立了MrgC基因沉默模型。

CFA致炎性痛模型为一种经典的研究慢性炎性痛的模型，单侧注射CFA诱导产生的痛觉过敏一般在4 h内发展，为炎性痛的急性期，24 h～48 h为慢性炎性痛早期，随后在7 d左右痛觉过敏有个小高峰，之后慢慢恢复。文献报道患侧的痛觉过敏可持续4～6周，而在健侧产生的炎性镜像痛一般在18 d以上［11］。以往的研究多集中在CFA慢性炎性痛早期，Jiang［14］等人发现在椎管内注射MrgC特异性激动剂牛肾上腺髓质 8－22肽(bovine adrenal medulla 8－22，BAM8－22）不能够影响正常大鼠的基础痛阈和削弱CFA引发的早期机械痛觉过敏(24 h），但能够削弱CFA引发的早期热痛觉过敏(24 h）。与该研究的结果相一致的是，本研究CFA造模前鞘内给与4次MrgC siRNA干扰(文献报道以2 μg/次剂量，4次注射该siRNA片段能够使正常大鼠的MrgC mRNA表达量下降50%［12］），与对照siRNA组比较，没有显著的改变大鼠的机械痛阈。CFA造模后24 h，可见两组的PWTs较造模前均显著下降，提示CFA模型的成功建立。但继续给与siRNA干扰直至CFA第7天，两组间机械痛阈仍未见明显差异。这结果表明抑制MrgC的表达未能影响CFA引发的机械痛觉过敏。另有Guan Y等［17］敲除Mrg基因家族(含MrgC基因）后鞘内注射BAM8－22能同时延缓CFA引起的早期机械痛觉过敏与热痛觉过敏(24 h），该现象可能是由于同时沉默了除MrgC基因之外的Mrg基因家族成员而引发的。因为本研究没有观察干扰MrgC基因对于CFA引起的热痛觉过敏的影响，这将是我们进一步研究的目标。

PKC是一种重要的细胞内信号转导分子［3］，在损伤或炎症引起的慢性痛觉过敏启动与维持中起着重要的作用［18］，它的膜移位和磷酸化是PKC被激活的重要标志［19］。Honan等人基于正常大鼠的原痛研究发现，鞘内给予 MrgC特异性激动剂BAM8－22，应用全细胞膜片钳技术发现与热痛密切相关的辣椒素受体(transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1）敏化的神经元大约占13%的DRG神经元，这一效应被PKC特异性抑制剂Ro－31－8220所抑制［6］;有研究表明鞘内注射BAM8－22抑制了CFA诱发的脊髓背角膜上PKCγ的上升［20］。以上研究提示PKC在MrgC对疼痛的调控中起着重要的作用。但是目前尚无DRG中PKC在MrgC对CFA诱发的慢性炎性痛调制过程功能性改变的研究。PKC的亚基ε在90%以上的DRG中小直径神经元中表达，其Ser729点位磷酸化是PKCε引发痛觉过敏的一个必要调节因素，本研究观察到在有效沉默MrgC基因后，PKCε的Ser729点位磷酸化水平明显上升，该结果提示抑制DRG中PKCε的Ser729点位磷酸化从而抑制PKCε功能性激活是MrgC调制CFA慢性炎性痛的重要细胞学机制。

综上所述，本研究在CFA慢性炎性痛的基础上成功地建立了 MrgC基因沉默模型，该模型中对MrgC的抑制作用显著上调PKCε Ser729磷酸化的水平，基于PKC是一个蛋白激酶，它激活了多种与疼痛密切相关的伤害性感受器，如TRPV1，下一步的研究将围绕着MrgC/PKC深入展开。

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SiRNA interference on expression of MrgC and phosphorylation of PKCε in ipsilateral dorsal root ganglion of rats with chronic inflammatory pain

LIN Xiao－xi，FANG Fang，FANG Jian－qiao，LIU Ying－jun
(The Third Clinical Medical College，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China）

Objective To observe the Interference effects of siRNA(small interference RNA）intrathecal injection on the expression of mRNA and protein of MrgC，on PWTs(paw withdrawal thresholds）and the phosphorylation of PKCε Ser729 in ipsilateral DRG(dorsal root ganglion）of rats with chronic inflammatory pain induced by CFA(complete freund’s adjuvant）．Methods 16 health adult male SD(Sprague－Dawley）rats were randomly divided into 2 groups：control siRNA group and MrgC siRNA group，8 rats in each group．After success of intrathecal catheterization，corresponding siRNA was injected in rats for 4d，once a day，5μg/d per rat．The model of chronic inflammatory pain was established by CFA(0．1ml per rat）subcutaneously injected into the right hind paw at 4th day post－administration，then two groups were administrated corresponding siRNA on alternate day and executed at the 11th day post－administration．The PWTs were measured at 5 time points of pre－intrathecal catheterization，pre－administration，4th day post－administration(0h post－CFA injection），5th day post－administration(24h post－CFA injection），11th day post－administration(7 d post－CFA injection）．The expression of MrgC mRNA in ipsilateral DRG was detected by fluorogenic quantitative PCR，and the expression of MrgC and the phosphorylation of PKCε Ser729 in ipsilateral DRG was detected by immumofluorescence method．Result Compared with 4th day post－administration，PWTs of both two groups at 5th day post－administration decreased significantly (P＜0．01）．While there was no significant difference of PWTs between two groups at every detective time point．Compared with control siRNA group，the expression of MrgC mRNA and the rate of MrgC positive cells in MrgC siRNA group both decreased significantly(P＜0．01，P＜0．05），whereas the rate of p－PKCε Ser729 positive cells increased obviously(P＜0．05）at 11th day post－administration．Conclusion MrgC siRNA can effectively interfere the expression of mRNA and protein of MrgC in L4－L6 ipsilateral DRGs of rats with chronic inflammatory pain induced by CFA，and the siRNA interference on MrgC can obviously up－regulate the phosphorylation of PKCε Ser729，while it has no significant effect on PWTs of rats．

SiRNA;MrgC;Phosphorylation of PKCε Ser729;Chronic inflammatory pain;Dorsal root ganglion

R－332

A

1671－7856(2015）07－0039－07

10．3969．j．issn．1671．7856．2015．007．009

国家自然科学基金资助项目(81202755）;浙江省医药卫生科技计划(2015KYA172）。

林小溪，女(1989－），硕士生。方芳，女(1976－），助理研究员。

方剑乔(1961－），男，教授，博士生导师。研究方向：针刺镇痛的效应基础研究。E－mail：Fangjianqiao7532@163．com。

2015－07－02