放射耐受性人小细胞肺癌亚株的建立

刘 静,田海梅,李艳芬,李 茉,王小兵,张 伟

（中国医学科学院肿瘤医院生物检测中心，北京 100021）

放射耐受性人小细胞肺癌亚株的建立

刘 静,田海梅,李艳芬,李 茉,王小兵,张 伟

（中国医学科学院肿瘤医院生物检测中心，北京 100021）

目的 建立肺癌NCI-H446细胞放射抗拒性亚株，为小细胞肺癌放射抗拒和逆转研究提供配对的细胞研究工具。方法 通过梯度照射NCI-H446细胞株诱导其耐放射性（共7500cGy），并通过检测细胞总的ATP含量的方法来监测细胞倍增时间，流式细胞仪检测细胞周期分布，以及应用多靶单击模型SF=1-（1-e-D/D0）N拟合细胞存活曲线分析其放射敏感参数的变化。结果 比较亲本与耐放射株的差异，放射生物学参数值分别为D0（1.9673，2.2756）、N（1.0016，2.6008）、Dq（0.6783，1.6860）、SF2（0.3623，0.7134），耐放射株SF2值为亲本的1.97倍，G2/M期细胞所占比由18.52％下降到7.84％。耐放射株的细胞形态发生变化，倍增时间比敏感株延长。结论 通过梯度照射建立了小细胞肺癌NCI-H446的耐放射亚株NCI-H446-R，与亲本细胞相比放射生物学参数有显著差异（P＜0.05），本研究成果为研究小细胞肺癌放射抗拒及耐放射逆转提供了新的细胞模型。

放射抗拒；小细胞肺癌；NCI-H446细胞株；细胞周期

由于环境污染日益加剧、吸烟等原因，肺癌已持续成为世界范围内最常见的恶性肿瘤，且发病率仍呈上升趋势，据《2012中国肿瘤登记年报》发布，从全国来看，肺癌居恶性肿瘤发病的第一位，每10万人约有 54人会患肺癌，占恶性发病率的18.74％，男性为女性的1.94倍［1]，极大威胁着人类的健康和生命。肺癌的病理类型中小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）约占肺癌发病总数的20％～25％。由于SCLC细胞倍增时间短、进展快，与其他肿瘤不同之处就是早期即倾向于远处转移，主要采取以放化疗为主的综合治疗［2]。然而，部分SCLC患者对放疗不敏感，放疗后易出现复发，肿瘤细胞对放射线抗拒是影响SCLC放疗效果的主要因素。

SCLC的放疗抗拒研究对提高肺癌的预后具有重要价值，国内已有分子和细胞水平的研究报道，但不足之处是细胞研究模型不统一且来源各不相同，尤为关键的是尚未稳定成株的肺癌细胞株并缺乏必要的参数鉴定。本研究选择来自 ATCC （american type culture collection）的小细胞肺癌NCIH446细胞株作为亲本细胞系，体外通过序贯辐射诱导的方法，诱导获得具有放射抗拒性的细胞亚株NCI-H446-R并稳定传代。同时，研究和摸索建立耐放射细胞系的实验方法，为其他耐放射细胞系的建立提供依据。

1 材料和方法

1.1 辐射诱导

应用医用电子直线加速器（X射线），品牌：Clinac 600C/D（由中国医学科学院肿瘤医院加速器室提供使用），由低剂量到高剂量按照2Gy、5Gy、8Gy、10Gy的顺序逐渐增加放射剂量，一次照射完成细胞恢复状态后，继续下一次照射。照射次数共12次，照射总剂量7500cGy，分别为：（2Gy×3次，5Gy ×3次，8Gy×3次，10Gy×3次），剂量率300cGy/min，射野大小：10 cm×10 cm，细胞瓶表面覆有约1.5 cm厚的补偿膜，照射后4 h换新鲜培养液。

1.2 细胞培养

NCI-H446细胞株来自ATCC，由本中心常规保存。 采 用 10％ FBS（Hyclone SH30084.03），RPMI1640（Gibco 31800105）培养基，37℃、5％CO2培养箱（Forma Model3111）中培养。照射后根据细胞密度传代，细胞状态稳定后继续下一次照射，照射前冻存部分细胞保种。

1.3 单克隆筛选细胞亚株

按照计划的放射剂量完成照射后，采用单克隆方法得到耐放射性及生长特性趋于统一的细胞，从而纯化细胞株。取对数生长期的细胞，0.25％胰酶消化成单个细胞后接种到96孔板上。每日观察克隆的形成情况，克隆形成后，显微镜观察标记出单克隆的孔，消化取出细胞并继续扩大培养，分别标记其亚株名称。选择生长状况良好的一个亚株并稳定传代30次以上，命名为NCI-H446-R。

1.4 放射敏感参数测定

通过经典的克隆形成实验，来检验NCI-H446-R的耐放射性。取对数生长期的NCI-H446与NCIH446-R细胞，胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞后，将细胞悬浮在含10％FBS的RPMI1640培养液中备用。细胞悬液按倍数稀释后，每种细胞设三个平行孔2 mL/孔，在标记为（0Gy，2Gy，4Gy，6Gy，8Gy）的不同12孔板中分别按600个/孔、1000个/孔、4000个/孔、8000个/孔和10000个/孔接种细胞，并轻轻转动使细胞分散均匀，4 h后按所标记剂量完成照射。照射后在37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中静置培养2周左右。当形成克隆的面积足够大（单克隆细胞数＞50个细胞）且克隆间不相连时终止培养。弃上清并用PBS小心浸洗2次。加甲醇2 mL，固定15 min，去固定液，加适量Giemsa染色10 min，用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。将12孔板置于显微镜下，统计形成的克隆数并计算得出存活分数值，实验重复一次。最后应用多靶单击模型绘制细胞存活曲线。

1.5 细胞周期测定

诱导的耐放射株经最后一次10Gy照射后，调整细胞状态最终稳定传代成NCI-H446-R细胞株。取对数生长期的敏感株与耐放射株细胞，胰酶消化制成单细胞悬液并计数，每种取约1×106个细胞离心去培养基，加75％冰乙醇固定，置于-20℃过夜。次日离心弃上清，PBS洗2次后加PI染色，经流式细胞仪（flow cytometry，FCM）检测两种细胞的细胞周期分部。最后，通过ModFit LT软件绘制细胞周期分部图，对比亲本株和耐放射株的细胞周期变化情况。

1.6 ATP法绘制细胞生长曲线

取对数生长期的敏感株与耐放射细胞株，消化细胞成单个后计数，调整细胞密度为2000个/mL。设8个平行孔，加200 uL/孔细胞悬液，每种细胞株分别接种8块96孔板，每块培养板分别标注对应的细胞株名称及第1天～第8天，置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养。通过检测每个孔中总的细胞内三磷酸腺苷（ATP）含量的方法（试剂盒购于：北京金紫晶生物医药技术有限公司），来观察细胞的增殖情况。每24 h检测一对培养板，连续测8 d，绘制细胞生长曲线。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 放射生物学参数

2.2 细胞周期变化

通过流式细胞仪测得的数据显示，NCI-H446-R与NCI-H446在细胞周期分布上存在显著差异（彩插7图2）。对比两株细胞的细胞周期所占比例，NCI-H446-R的G1期与S期细胞所占比例分别由63.52±8.25％和17.96±2.93％上升到67.94± 6.02％和24.23±2.26％；G2/M期细胞由18.52± 3.14％下降到7.84±2.19％，结果显示耐放射细胞株G1期和S期比例增多，G2/M期比例减少。

2.3 细胞生长差异

细胞在射线照射驯化过程中，会出现大片死亡脱落，镜下观察可见不同程度的细胞变形增大、多伪足，细胞内外颗粒较多，细胞内出现大量空泡、核变大及多核等特征。随着照射剂量的不断加大，细胞恢复状态的时间也随之加长。通过ATP法检测并绘制细胞生长曲线（彩插7图3），NCI-H446约在第2天进入对数生长期，第6天进入平台期；NCIH446-R在第3天进入对数生长期，第8天进入平台期。耐放射株的倍增时间较敏感株延长。在相同的培养条件下，NCI-H446-R的细胞形态较其亲本株也有所不同。

图1 多靶单击拟合模型拟合的NCI-H446＆NCIH446-R细胞存活曲线

3 讨论

目前国内外相关研究者已经通过不同的诱导方法建立起多种不同组织来源的耐放射细胞亚株［3-5]，并对获得的耐放射细胞进行了系统的耐放射性分析。对于细胞耐放射性的产生机制主要有两种不同的观点。首先，有观点认为同一细胞群中即使是同一来源的细胞也存在着放射敏感性不同的细胞亚群。即使是同一细胞来源的肿瘤细胞，在内外环境的不断作用下，对放射线的敏感程度也存在差异，放射线选择性的杀死了放射敏感的细胞，使放射抗拒的细胞存活下来并不断增殖，并使其后代也具有了耐放射性；另外，有学者认为，在照射过程中虽然杀死了大部分的肿瘤细胞，但同时也诱导了部分细胞突变，使其具有耐放射性并不断增殖［6]。总之，放射线照射后存活的细胞具有了辐射耐受性，它和亲本细胞是具有同一来源放射敏感性不用的细胞株。

本研究采用多次照射、逐步增加放射剂量的方法诱导出耐放射性较高的细胞亚株，总的照射剂量为7500cGy。从细胞株的初次诱导，到细胞稳定传代后完成耐放射性鉴定，历时16个月。设定的照射剂量完成后，通过亚克隆实验纯化出单克隆株，使其生物特性更趋于一致。最后通过经典的克隆形成实验来检测并计算其放射生物学参数：终斜率D0值、准阈剂量 Dq值、外推值 N和 SF2。计算得出，NCI-H446-R的SF2值为其亲本株的1.97倍，有显著差异（P ＜0.05）性。不同细胞周期对放射的敏感性也不同，一般S期的细胞最抗拒，G2/M期对放射线最敏感［7]。通过流式细胞仪检测，NCI-H446-R的G2/M期所占比例为7.84％，亲本株为18.52％，存在显著差异（P ＜0.05）。辐射损伤主要表现为细胞再增值能力的丧失，细胞经放射线照射后的1～2代之内细胞并未有明显变化，待传至2～3代后细胞会出现大片死亡、脱落，发生有丝分裂性死亡，失去肿瘤的无限增值能力。存活的细胞在形态上会出现显著的变化，细胞核质比增大，双核；细胞内颗粒物增多，多空泡；生长速度变慢，代谢加快；细胞个体间形态差异较大，多伪足。传至8～10代以后，细胞形态逐渐恢复，趋于统一，增殖速度和代谢水平也逐渐恢复。最终诱导出的耐放射细胞株NCI-H446-R，较敏感株在细胞形态和倍增时间上也有所不同，在某种程度上也验证了细胞周期的检测结果。

总之，本研究通过梯度照射法，模拟临床上耐放射细胞的形成过程，建立了小细胞肺癌细胞株NCI-H446的放射抗拒性细胞亚株NCI-H446-R并稳定传代，通过克隆形成等实验验证了其耐放射性［9-10]。在未来的工作中，我们将进一步利用获得的放射抗拒细胞株，来开展有关小细胞肺癌放射抗拒及耐放射逆转等相关研究。

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The establishment of a radiation-resistant small cell lung cancer subline

LIU Jing，TIAN Hai-mei，LIYan-fen，LIMo，WANG Xiao-bing，ZHANGWei
（Tumor Marker Research Center，Cancer Institute＆Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100021，China）

Objective To establish a radiation-resistant cell subline from a human small cell lung cancer（SCLC）cell line NCI-H446，providing a pairing research tool for investigating mechanism of radiation tolerance and the reverse strategy in lung cancer.Methods The NCI-H446 cell was radiated repeatedly by increased dose of radiation gradually （total7500cGy）and a radiation-resistant cell substrain was induced and selected from the survival of cells.The doubling time and cell cycle distribution of the substrain were detected by ATP kit and flow cytometry Assay respectively；Radiation biology parameters were calculated and analyzed by cell survival curve fitting from multi-targetmodel，SF=1-（1-e-D/D0）N.Results Comparing with the control，The resistant substrain radiobiology parameter values were D0（1.9673，2.2756），N（1.0016，2.6008），Dq（0.6783，1.6860）and SF2（0.3623，0.7134）respectively.Cellmorphology ismore slender and hasmore tentacles.The SF2value of radiation-resistant subline is 1.97 timesmore than that ofwild cell line.The proportion of radiation-resistant cells in G2/M-phase was down to 7.84％，compared with the 18.52％ofwild cells.Conclusions A radiation-resistant SCLC subline NCI-H446-R is established andmay be a useful tool for studying resistant to radiation of SCLC in the future.

Radiation resistance；Small cell lung cancer；NCI-H446 cell line；Cell cycle

张伟（1964-），男，研究员，研究方向：主要从事转化医学研究。E-mail：zhangww1954@126.com。

R-332

A

1671-7856（2015﹞10-0051-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.010.012

刘静（1984-），女，研究实习员，研究方向：肿瘤细胞相关实验研究。E-mail：liujingcicams@163.com。

﹞2015-08-18

研究报告