冻干保护剂对复合低温乳酸菌发酵剂的影响

张 炎,张卫兵,宋雪梅,杨 敏,田菊梅,梁 琪

(甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃省功能乳品工程实验室,甘肃兰州 730070)

冻干保护剂对复合低温乳酸菌发酵剂的影响

张 炎,张卫兵,宋雪梅,杨 敏,田菊梅,梁 琪*

(甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃省功能乳品工程实验室,甘肃兰州 730070)

以青藏高原牧区分离筛选出的低温乳酸菌为研究对象,以活菌数为指标,比较了4种冻干保护剂对复合低温乳酸菌发酵剂的影响,并通过正交实验优化了其中3种较优冻干保护剂的复配配方。结果表明,复合低温乳酸菌冻干保护剂的最优组合为:甘油为8mL/L,蔗糖为10%(w/v),脱脂乳为15%(w/v),以此为保护剂冻干存活率达到了90.55%。与商业发酵剂相比,低温发酵剂发酵酸乳组织状态良好,滴定酸度为92°T,感官评分为95分,活菌含量(10.3lgCFU/mL)极显著高于商业发酵酸乳(p<0.01)。实验结果为制备高活力直投式低温乳酸菌发酵剂的冻干菌粉提供理论支撑,对开发低温乳酸菌发酵剂具有重要意义。

低温乳酸菌,冻干保护剂,发酵剂

酵乳的良好风味是多种物质相互平衡的结果,一般需要12～24h完成香味物质的积累,我国牧民生产酸乳属于典型的自然发酵,由于牧区常年温度较低,因此牧区生产酵乳属于低温发酵(20～25℃),隔夜发酵即成风味良好的发酵酵乳[1]。国内外对于低温乳酸菌的研究多集中于冷藏肉、发酵肉制品及泡菜中[2-5]。Salama等[6]研究了分离自植物资源中的乳酸乳球菌乳脂亚种,结论是21℃下发酵需要17～18h凝乳。李静等[7]研究了低温发酵酸乳的品质,结果表明在25℃菌株发酵的酸乳凝乳状态较好,后酸化较弱,低温也有利于产香物质的积累。

发酵剂是决定发酵乳品质的一个重要因素。普通发酵剂存在着含菌量低、制作过程繁杂、易染杂菌和噬菌体等种种弊端,目前已被活力高、使用方便的直投式发酵剂取而代之。高浓度菌液在经过真空冷冻干燥时,细胞会因冰晶的形成受到机械损伤,同时细胞膜完整性也会遭到破坏[8-9]。冻干保护剂不仅能提高菌体在冻干过程中的抗性,还可以将菌体包裹在介质中,减少菌体与氧的直接接触,提供良好的休眠环境,延长菌株保藏期[10-11]。因此,在冻干时添加合适的保护剂是一种很好的保护措施。

我国缺乏商品化乳酸菌发酵剂,且目前发酵乳大部分属于高温短时间发酵(42℃左右发酵3～4h),此种发酵虽然发酵速度快,但在贮藏过程中会出现后酸化强、乳清析出、乳酸菌活菌数偏低、酸乳特有风味不足等质量问题[12-14]。因此,本实验以牧区分离筛选出的低温乳酸菌为研究对象,对冷冻干燥过程中影响较大的保护剂做了研究,确定了最佳复合保护剂配方,并对菌粉的发酵性能进行了测定,为制备高活力直投式低温乳酸菌发酵剂的冻干提供理论支撑,对开发低温乳酸菌发酵剂具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器1.1.1 实验材料 实验菌株:Lactococcuslactissubsp. Lactis Q8(保藏号:CGMCC4776);LactobacilluscaseiG5(保藏号:CGMCC4775) 甘肃省功能乳品工程实验室分离并保藏于中国普通微生物菌种保藏中心。

市售脱脂乳粉 黑龙江完达山乳业股份有限公司;鲜牛奶 甘肃农业大学奶牛养殖基地。商业酸奶发酵剂:BP-32直投式冻干发酵菌粉 法国丹尼斯克公司。

试剂:蛋白胨,牛肉膏,酵母膏,琼脂,等为生化试剂,谷氨酸钠,甘油,蔗糖,氯化钠,硫酸铵,氢氧化钠,草酸,盐酸等为分析纯试剂。

pH6.86缓冲液:50mL 11.876g/L Na2HPO4溶液和50mL 9.078g/L NaH2PO4溶液混匀。

脱脂乳培养基:将脱脂乳粉用蒸馏水复原成12%(W/V)的脱脂乳,115℃灭菌10min;

改良MRS液体培养基:蛋白胨10g,牛肉膏10g,胰蛋白胨5g,K2HPO4·3H2O 2g,乙酸钠5g,葡萄糖23g,吐温-80 1mL,柠檬酸二铵2g,MgSO4·7H2O 0.58g,MnSO4·4H2O 0.25g,4%土豆汁,6%胡萝卜汁,8%番茄汁,水1000mL,调节pH6.2～6.4,121℃灭菌15min;

计数培养基:MRS琼脂培养基。

1.1.2 实验仪器 SW-CJ-2FD 超净工作台 苏州净化设备有限公司;电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司;立式灭菌器 上海三申医疗器械有限公司;Primo Star显微镜 德国卡尔蔡司公司;LVDV-1粘度计 上海万磁仪器有限公司;PHS-3C型紧密pH计 上海虹盖仪器仪表有限公司;BP121S电子天平 德国赛多利斯集团;冷冻真空干燥机 北京速原中天科技有限公司;TGL-20高速台式冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司等。

1.2 实验内容

1.2.1 菌种活化 将冷冻保藏的菌株在室温下解冻后,于无菌条件下接种到MRS液体培养基中富集,再按3%(V/V)的接种量转接到脱脂乳培养基中,25℃恒温条件下培养至凝乳,重复5～6次以恢复菌株活力,备用。

1.2.2 种子液制备 将活化后的两菌株,以接种量3%(V/V)分别接入MRS液体培养基,于25℃恒温振荡培养14h得到种子液。

1.2.3 收集菌体 将Q8种子液和G5种子液按2∶1(V/V)充分混合后,以3%(V/V)的接种量接入改良MRS液体培养基中,25℃下培养至12h后添加2.0%(v/v)缓冲液,此后每隔2h添加一次缓冲液,16h后结束发酵,4℃下5000r/min离心20min,弃去上清液,收集菌体备用。

1.2.4 菌悬液的制备 在前期实验的基础上,将上述菌泥与冻干保护剂以1∶3(V/V)比例混合,用旋涡振荡器充分悬浮,制成悬浮液备用。

1.2.5 冷冻干燥保护剂的筛选

1.2.5.1 谷氨酸钠对冻干发酵剂菌体存活率的影响 将收得菌泥与保护剂按1∶3(V/V)混合制成菌悬液后,分别将添加5、10、15、20、25g/L谷氨酸钠的菌悬液分装于冻干瓶中,每瓶1mL,冻干后计算冷冻干燥后菌体的存活率。实验重复3次,取平均值。

1.2.5.2 甘油对冻干发酵剂菌体存活率的影响 将收得菌泥与保护剂按1∶3(V/V)混合制成菌悬液后,分别将添加2、4、6、8、10mL/L甘油的菌悬液分装于冻干瓶中,每瓶1mL,冻干后计算冷冻干燥后菌体的存活率。实验重复3次,取平均值。

1.2.5.3 蔗糖对冻干发酵剂菌体存活率的影响 将收得菌泥与保护剂按1∶3(V/V)混合制成菌悬液后,分别将添加5%、10%、15%、20%、25%蔗糖的菌悬液分装于冻干瓶中,每瓶1mL,冻干后计算冷冻干燥后菌体的存活率。实验重复3次,取平均值。

1.2.5.4 脱脂乳对冻干发酵剂菌体存活率的影响 将收得菌泥与保护剂按1∶3(V/V)混合制成菌悬液后,分别将添加5%、10%、15%、20%、25%脱脂乳的菌悬液分装于冻干瓶中,每瓶1mL,冻干后计算冷冻干燥后菌体的存活率。实验重复3次,取平均值。

1.2.5.5 保护剂优化正交设计 在单因素基础上筛选出对菌株保护作用最好的三种保护剂进行正交优化,以冻干存活率为指标,筛选出复合保护剂中各保护剂的最佳添加水平。复合保护剂正交实验因素水平表见表1。

表1 复合保护剂正交实验因素水平表

1.2.6 乳酸菌的冻干

1.2.6.1 预冻方法 将准备好的菌悬液快速放入-30℃冰箱,进行约8h的预冻。

1.2.6.2 干燥方法 真空冷冻干燥之前对冷冻干燥机进行消毒处理(75%酒精),开机后以2℃/min连续降温大约30min,立即将预冻好的样品放入冷冻干燥箱,盖好机器后立即开始抽真空,进入干燥状态。冷冻干燥约24h之后,从干燥机的透明视窗观察发现管内没有明水,同时菌泥内部出现很多小孔和缝隙时,结束冷冻干燥。在真空状态下将菌粉包装好后取出置于4℃低温保藏。

1.2.7 冻干菌粉发酵性能测定 将冻干菌粉加入已灭菌的0.85%生理盐水中,常温复水30min。将复水菌液按0.03%(w/v)的接种量接种于灭菌的液体脱脂乳培养中,在25℃恒温培养至凝乳,记录凝乳时间,测定滴定酸度、活菌数并进行感官评价,计算冻干存活率。以商业发酵剂作对照。

冻干存活率(%)=冻干后菌数/冻干前活菌数×100

1.2.7.1 滴定酸度 参考GB/T5413.34-2010,用浓度0.1mol/L的NaOH测定其滴定酸度(以°T表示)。

1.2.7.2 菌体生长的测定 参照Sahadeva等[15]方法,采用稀释平板法计数。无菌操作条件下用0.85%无菌生理盐水将发酵乳稀释至一定稀释度,取0.lmL涂布于计数培养基上,置于25℃培养48h,进行菌落计数,每个样品重复3次,活菌数用lg CFU/mL表示。

1.2.7.3 感官评价 参照Behare等[16]的方法并作一定修改,发酵乳样于4℃冷藏24h,由10位具有食品专业知识的感官评价人员对样品的感官特征进行综合界定,感官评价总分100分,评分标准分为色泽10分、滋气味40分、组织状态50分。感官评价标准见表2。

表2 酸奶感官评分标准

1.2.8 数据统计 用Excel整理实验数据并计算标准差,采用SPSS17.0进行最小显著差异方差分析。

2 结果与讨论

2.1 保护剂筛选单因素实验结果

2.1.1 谷氨酸钠对冻干发酵剂菌体存活率的影响 谷氨酸钠对冻干发酵剂菌体存活率的影响如图1所示,由图可知,随着谷氨酸钠添加浓度的增加冻干存活率呈现先增大后减小的趋势,但总体来看,谷氨酸钠对冻干保护的贡献并不明显,冻干存活率仅达到23%左右,而且不同浓度之间差异性不明显。

图1 谷氨酸钠对冻干发酵剂菌体存活率的影响Fig.1 Effect of sodium glutamate on freeze-dried survival rates of low temperature LAB

2.1.2 甘油对冻干发酵剂菌体存活率的影响 甘油对冻干发酵剂菌体存活率的影响如图2所示,由图可知,随着甘油添加浓度的增加冻干存活率呈现先增大后减小的趋势。甘油浓度为6mL/L时冻干存活率最大为 47.62%,高于或低于此浓度都不利于冻干保护作用。甘油作为小分子物质,可以自由透过细胞与胞内的水分子发生水合,延缓水的结晶,在干燥时又会减缓细胞脱水,有效防止了细胞的死亡,但是以甘油作为冻干保护剂时浓度不宜过高,因为甘油的吸湿性会延长冻干时间,浪费能源。

图2 甘油对冻干发酵剂菌体存活率的影响Fig.2 Effect of glycerol on freeze-dried survival rates of low temperature LAB

2.1.3 蔗糖对冻干发酵剂菌体存活率的影响 蔗糖对冻干发酵剂菌体存活率的影响如图3所示,由图可知,随着蔗糖添加浓度的增加冻干存活率呈现先增大后减小的趋势。当蔗糖添加量为10%时,冻干存活率达到最大值(35.32%)。蔗糖的保护作用源自它在干燥过程中包裹细胞,同时代替水的结构功能,防止蛋白质结构的变化,起到抗干燥作用从而发挥保护作用。

图3 蔗糖对冻干发酵剂菌体存活率的影响Fig.3 Effect of sucrose on freeze-dried survival rates of low temperature LAB

2.1.4 脱脂乳对冻干发酵剂菌体存活率的影响 脱脂乳对冻干发酵剂菌体存活率的影响如图4所示,由图可知,随着脱脂乳添加浓度的增加冻干存活率呈现先增大后减小的趋势。当脱脂乳添加量为15%时,冻干存活率达到最大值(67.06%)。

表4 冻干成品发酵剂性能检验结果

注:角标为不同小写字母的每列数据之间差异显著(p<0.05),不同大写字母的差异极显著(p<0.01)。

脱脂乳可以保护菌体细胞壁在干燥过程中的损坏,从而提高菌体存活率,而且脱脂乳中其他成份如乳糖也会提高菌体的抗冻性,但是冻干样品会随脱脂乳浓度的增加变得粘稠,水分不易蒸发会导致冻干过程形成大而多的冰晶对菌体造成损伤,所以应选择合适的浓度添加。

图4 脱脂乳对冻干发酵剂菌体存活率的影响Fig.4 Effect of skimmed milk on freeze-dried survival rates of low temperature LAB

2.2 复合保护剂正交实验结果

单因素实验结果显示,以某单一物质为冻干保护剂时,冻干保护效果均较低,不能满足冻干产品的活菌数要求。因此在单因素的基础上对保护效果较好的三种保护剂进行正交实验,考察保护剂对存活率的影响,确定三种保护剂的复配浓度。

表3 保护剂正交实验结果

从表3中极差结果可以看出,三种保护剂对菌体冻干存活率的影响各不相同,保护效果从大到小依次为脱脂乳>甘油>蔗糖。正交优化最优复合冻干保护剂组合为A3B2C2,即甘油浓度8mL/L,蔗糖浓度10%,脱脂乳浓度15%,但是优化出最优组合未出现在正交实验组,为了进一步确定正交实验的准确性,在相同条件下,对A3B2C2组合与A3B3C2组合进行一次验证实验。结果表明,在优化组合A3B2C2条件下,冻干存活率达到了90.55%,高于实验组最大值,因此,确定组合A3B2C2为复合保护剂配方,即以8mL/L甘油,10%蔗糖,15%脱脂乳为低温乳酸菌的复合保护剂。

2.3 冻干成品发酵剂性能

将冻干的低温乳酸菌粉与商业发酵剂进行发酵剂性能对比,结果见表4。由表可知,低温发酵剂发酵酸乳活菌含量高达10.3lgCFU/mL,极显著高于商业发酵剂发酵酸乳活菌含量(p<0.01),这可能是因为实验所制发酵菌粉含菌量高,导致酸奶中活菌基数大。低温发酵剂发酵的酸乳香味明显、酸甜适中、组织状态良好、无乳清析出,感官评分(95分)显著高于商业发酵剂发酵酸奶(p<0.05)。风味物质产生的高峰期一般在4h左右,但酸乳良好风味是由多种物质相互平衡导致的结果,所以要想得到理想的风味,一般需要更长时间才能完成,本实验制得低温发酵剂所需凝乳时间较商业发酵剂凝乳时间长,因此低温长时间发酵积累了更多的风味物质,使产品风味浓厚饱满、酸甜爽口。通过对低温乳酸发酵剂与商业发酵剂性能的比较,进一步突出了低温乳酸菌发酵剂的优点。

3 结论

正交实验结果显示,三种保护剂的保护效果从大到小依次为脱脂乳>甘油>蔗糖。正交实验优化的最优复合冻干保护剂组合为A3B2C2,即甘油浓度8mL/L,蔗糖浓度10%,脱脂乳浓度15%,在此优化组合条件下,冻干存活率达到了90.55%。将冻干低温乳酸菌粉与商业发酵剂进行发酵剂性能对比发现,低温发酵剂发酵酸乳属于常长时间凝乳,滴定酸度为92.2°T,香味明显、酸甜适中、组织状态良好、无乳清析出,感官评分(95分)显著高于商业发酵剂发酵酸奶(p<0.05);活菌含量为10.3lgCFU/mL,极显著高于商业发酵剂活菌含量(p<0.01)。

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Effect of cryoprotectant on low temperature lactic acid bacteria complax starter

ZHANG Yan,ZHANG Wei-bing,SONG Xue-mei,YANG Min,TIAN Ju-mei,LIANG Qi*

(College of Food Science and Engineering,Functional Dairy Product Engineering Lab of Gansu,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Low temperature lactic acid bacteria,isolated from traditional fermented yak milk from qinghai-tibet plateau areas were used as the research object. The impact of four kinds of cryoprotectants on the survival rate of lactic acid bacteria complax starter during storage was assessed. Based on the results,orthogonal experiment was adopted to optimize cryoprotectant composition. The results showed that the optimum cryoprotectant composition was glycerol 8mL/L,sucrose 10%(w/v),skimmed milk 15%(w/v). The rank of protection effect on the viable counts was skimmed milk>glycerol>sucrose,and the freeze-dried survival rate was 90.55%. Compared with commercial starter culture,low temperature starter fermented yogurt had better texture,and the acidity was 92°T. The sensory evaluation value was 95 points,and the viable counts(10.3lgCFU/mL)significantly higher than commercial starter culture fermented yogurt(p<0.01).

low temperature lactic acid bacteria;cryoprotectant;starter

2014-05-27

张炎(1983-)，男，硕士，实验师，研究方向：畜产品加工。

*通讯作者:梁琪(1969-)，女，教授，研究方向:畜产品加工。

兰州市科技创新人才团队培育计划项目(2011-1-144)；兰州市农业科技攻关项目(2010-1-29)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)07-0144-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.022