金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶耐药基因的克隆及其原核表达

陈洪升 周帅 陈吟霜 谢永强 张咏莉 周珍文

·实验研究·

金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶耐药基因的克隆及其原核表达

陈洪升 周帅 陈吟霜 谢永强 张咏莉 周珍文

目的 在大肠杆菌中克隆、表达金黄色葡萄球菌氨基糖苷类耐药基因：腺苷酰转移酶基因, 为其功能研究奠定基础。方法 按金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶蛋白编码序列设计引物, 以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板, 扩增腺苷酰转移酶基因。将所得片段与pGEX-4t-1(+)载体连接, 转化到感受态大肠杆菌BL21(DE3), 提取质粒进行双酶切及测序鉴定, IPTG诱导重组蛋白表达, SDS-PAGE及Western-blot对重组蛋白进行鉴定。结果 使用金黄色葡萄球菌基因组为模板, 成功扩增约800 bp目的片段, 重组质粒双酶切见目的片段, 测序显示腺苷酰转移酶基因长783 bp, 启始于ATG, 终止于TAG,预测的等电点及分子量分别为7.75、28975.44, 目的基因与Genbank金葡腺苷酰转移酶同源性为99%, SDS-PAGE及Western-blot显示在55 kD左右见重组蛋白表达。结论 在大肠杆菌中成功克隆、表达了金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶基因, 为其功能研究提供了物质基础。

金黄色葡萄球菌；腺苷酰转移酶；耐药基因；克隆；表达

金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus, SA)是人类化脓感染中最常见的病原菌, 可引起局部化脓感染, 也可引起肺炎及败血症、脓毒症等全身感染。随着氨基糖苷类药物(aminoglycosides)的广泛应用, 金黄色葡萄球菌对氨基糖苷耐药日益严重。腺苷酰转移酶是一种跨膜多重药物外排蛋白,介导了葡萄球菌对氨基糖苷类药物(主要是亲水性氨基糖苷类药物)及多种结构上近似甚至无关的药物耐药［1］。本研究对腺苷酰转移酶基因进行克隆、及原核表达, 为其功能研究奠定基础。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 金黄色葡萄球菌菌株(111123035)分离自广州市妇女儿童医疗中心内科病区11岁儿童全身多发软组织感染的脓液。

1.1.2 主要试剂及器材 pGEX-4T-1(+)质粒载体购自法国马来亚公司；质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒、rTaq DNA聚合酶、EcoR Ⅰ, Xho Ⅰ限制性内切酶、T4 DNA连接酶DNA marker等购自Takara公司。IPTG、丙烯酰胺、Tris碱、预染蛋白Marker和DAB显色剂等购自鼎国生物公司。鼠抗GST标签单克隆抗体购自北京康为世纪生物有限公司。上海力申公司HF safe-1200型生物安全柜, 德国Biometra公司PCR, 英国uvitec公司GAS7508-T20紫外凝胶成像分析系统,德国Sorvall公司micro 17R台式高速冷冻离心机。

1.2 方法

1.2.1 最低抑菌浓度(MIC)测定 按照CLSI(2012)《抗微生物药物敏感试验的执行标准》, 采用琼脂二倍稀释法进行。

1.2.2 腺苷酰转移酶基因PCR扩增 根据GenBank金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶基因序列(CP002120.1), 设计特异性引物一对：P1：5'-CGCGAATTCATGAGCAATTTGATTAACGG-3', P2：5'-CGCCTCGAGCTAATTGAGAGAAGTTTCTA-3'。引物序列分别加入EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位点, 进行PCR反应。

1.2.3 腺苷酰转移酶基因克隆入pGEX-4T-1(+)表达载体 腺苷酰转移酶基因 PCR产物纯化后, 经EcoRⅠ、XhoⅠ酶切纯化后, 与经相同酶切的pGEX-4T-1(+)质粒连接,转化入大肠杆菌BL21(DE3)。挑取经氨苄霉素筛选的阳性菌落提取质粒进行PCR及双酶切鉴定。

1.2.4 腺苷酰转移酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)的诱导表达 将含有重组质粒的BL21(DE3)工程菌接种于含氨苄霉素(50 μg/ml)的LB琼脂板, 培养过夜后挑单菌落于含氨苄霉素LB液体培养基中37℃培养至OD值0.4左右, IPTG诱导表达8 h, 离心20 min收集菌体, SDS-PAGE电泳鉴定。

1.2.5 重组蛋白Western blot分析 重组蛋白表达产物经SDS-PAGE后电转移至PVDF膜, 使用HRP标记的GST标签鼠单克隆抗体, DAB显色液显色。

2 结果

2.1 氨基糖苷类抗菌药物的MIC 临床分离金黄色葡萄球菌菌株(111123035)对氨基糖苷类药物庆大霉素、阿米卡星的MIC分别为18、16 μg/ml。参照CLSI(2012)《葡萄球菌属的MIC(μg/ml)解释标准》, 均为耐药。临床检验该菌株对头孢西丁MIC值为18 μg/ml, 参照CLSI(2012)《耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的检测方法及判定折点》, 该菌株为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株。

2.2 腺苷酰转移酶基因的PCR扩增 以临床分离株基因组DNA为模板, PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳, 结果显示在800～1000 bp间见明显特异性条带(见图1), 与目的基因(783 bp)大小相似。

图1 腺苷酰转移酶基因的PCR扩增

2.3 重组质粒的鉴定 从转化的大肠杆菌BL21提取的重组质粒, 经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后见目的条带。测序显示腺苷酰转移酶基因长783 bp, 启始于ATG, 终止于TAG, 预测的等电点为7.75, 分子量为28975.44, 与Genbank中编号为NC_017341.1的基因同源性为99%。氨基酸比对结果显示仅见49位氨基酸D改变为Y。

2.4 SDS-PEGE电泳及Western-blot 0.5 mmol的IPTG诱导8 h后, 重组菌体经SDS-PEGE电泳后, 在55 kD可见明显表达带(见图2), 这与融合重组蛋白的理论分子量相符(26 kD GST+29 kD adenylyltransferase)。

图2 重组腺苷酰转移酶12% SDS-PAGE电泳图

2.5 重组adenylyltransferase Western blot分析鉴定 使用鼠抗GST标签单克隆抗体进行Western-blot, 结果显示在55 kD左右位置见目的蛋白(见图3)。

图3 重组蛋白表达产物Western-blotting

3 讨论

金黄色葡萄球菌为化脓性感染的主要致病菌, 本实验从儿童全身多发软组织感染脓液标本分离出一株高耐药株(111123035), 其为MRSA, 对庆大霉素、阿米卡星的MIC分别为18、16 μg/ml, 表明其对氨基糖苷类药物高度耐药。

对庆大霉素等氨基糖苷抗生素耐药是因细菌产生氨基糖苷类双功能修饰酶AAC(6’)-APH(2”)钝化酶所致［2］。该种耐药性的决定因子在PSK-1样质粒上。1988 年英国 Jordens等发现金黄色葡萄球菌对庆大霉素耐药性并非质粒携带, 而是染色体携带。

在大肠杆菌、酵母菌等均进行了腺苷酰转移酶耐药基因分离及鉴定［3］, 发现adenylyltransferase基因序列和蛋白分子量与报道相符［4］。

本实验成功地对染色体介导的氨基糖苷耐药基因adenylyltransferase进行了克隆和原核表达, 得到了adenyly ltransferase蛋白［5］, 为进一步进行adenylyltransferase蛋白高级结构测定的试验做好了准备；为了解adenylyltransferase蛋白的特性和功能以及其对细菌耐药机制的深入研究奠定了基础［6］。

［1］ Borgundvaag B, Ng W, Rowe B, et al.Prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in skin and soft tissue infections in patients presenting to Canadian emergency departments.CJEM, 2013, 15(3):141-160.

［2］ Woegerbauer M, Zeinzinger J, Springer B, et al.Prevalence of the aminoglycoside phosphotransferase genes aph(3')-Ⅲa and aph(3')-Ⅱa in Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica subsp.enterica and Staphylococcus aureus isolates in Austria.J Med Microbiol, 2014, 63(Pt 2):210-217.

［3］ 苟冬梅, 梁丽亚, 刘嵘明, 等.过量表达烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶对大肠杆菌NZN111产丁二酸的影响.生物工程学报, 2012, 28(9): 1059-1069.

［4］ 郭静霞, 魏红山, 宋永继, 等.高尔基体蛋白73原核表达系统的构建及单克隆抗体的制备.中华实验和临床病毒学杂志, 2013, 27(4): 301-303.

［5］ 黄学勇, 刘国华, 胡小宁, 等.肠道病毒71型外壳蛋白VP2基因重组表达及活性鉴定.中华预防医学杂志, 2014, 48(4): 324-327.

［6］ 高珺珊, 吴威, 侯洪烈, 等.犬恶丝虫酪蛋白激酶2β亚基基因片段的克隆和原核表达.中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2013, 31(4): 290-292.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.12.196

2014-12-18］

广州市医药科技重点项目(项目编号：201102A212013)；广州市医药科技项目(项目编号：20131A011053)

510006 广东药学院(陈洪升 张咏莉)；广州市妇女儿童医疗中心(周帅 陈吟霜 谢永强 周珍文)

张咏莉 周珍文