X连锁无汗性外胚层发育不良一家系的产前诊断及遗传咨询

朱娟 潘小英 吴菁 丁红珂 何薇

(广州医科大学广东省妇幼保健院，广东 广州 510010)

X连锁无汗性外胚层发育不良一家系的产前诊断及遗传咨询

朱娟 潘小英 吴菁 丁红珂 何薇*

(广州医科大学广东省妇幼保健院，广东 广州 510010)

目的 对一X-连锁无汗性外胚层发育不良(XLHED)的家系进行EDA基因诊断，探讨XLHED的产前诊断方法及遗传咨询。方法 提取先证者、孕妇外周血及胎儿羊水细胞DNA，应用聚合酶链反应(PCR)技术结合直接测序法检测EDA基因，并进行针对性的遗传咨询及优生指导。结果 孕妇为EDA基因7号外显子c.871G>A杂合突变，先证者及胎儿均为EDA基因7号外显子c.871G>A纯合突变，孕妇经遗传咨询后根据伦理原则要求终止妊娠。结论 在本家系中，EDA基因c.871G>A突变为导致X-连锁无汗性外胚层发育不良的原因，对EDA基因突变检测可对XLHED进行产前诊断。

X-连锁无汗性外胚层发育不良; 基因突变; 产前诊断

Objective To investigate a procedure for genetic counseling and prenatal diagnosis of X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia (XLHED) by mutation detection in a family with XLHED. Method Collected the peripheral blood and fetal amniotic fluid cells,EDAgene were amplified with polymerase chain reaction (PCR) technique and directly sequenced. Results Pregnant women appear forEDAgene 7 extra child c. 871 g>A hybrid mutation, the proband and fetus are 7 extraEDAgene show son c. 871 g>A homozygous mutations. Conclusions In this family,EDAgene 7 extra child c. 871 g>A mutations detection lead to XLHED,EDAgene mutation detection can make prenatal diagnosis for the XLHED. 【Key words】 X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia; gene mutation; prenatal diagnosis

外胚层发育不良(ectodermal dysplasia，ED) 是一种罕见的以汗腺、毛发及牙齿等外胚层组织发育不良或形态缺陷为主要特征的遗传性疾病，出生发病率约为1∶100 000。X-连锁无汗性外胚层发育不良(X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia，XLHED)是ED中最常见的一种类型，为X染色体连锁隐性遗传疾病，其临床表现为毛发稀少、汗腺发育不全、前额突出、无牙或少牙畸形、皮肤及其附属器官异常[1]。XLHED患儿由于皮肤散热系统异常，早期死亡率高达30%，余者可因环境温度、日光照射及剧烈运动而导致高热，严重影响工作、生活甚至威胁生命[2]。由于无有效治疗方法，产前诊断是预防和减少XLHED患儿出生的有效措施。本文对1例散发XLHED患儿及其母亲、高危胎儿应用聚合酶链反应(PCR)技术结合直接测序法检测EDA基因，并对XLHED疾病进行遗传咨询和优生指导，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 ①先证者：男，7岁，第一胎足月顺产，出生后发现全身无汗，毛发稀少，无眉，鼻梁塌陷，剧烈运动后烦躁，常不明原因发热，全身皮肤干燥，粗糙，牙齿四颗，尖锥样，上下各两个，智力发育正常，在外院诊断为“无汗性外胚层发育不良综合征”。②孕妇：30岁，孕2产1宫内妊娠24周单活胎，为先证者母亲，既往体健，全身皮肤毛发无异常，非近亲婚配。孕期顺利，定期产检无特殊不适。③家系及其他成员：丈夫及家族中无类似病例发生。

1.2 研究方法 本研究经过本院医学伦理委员会批准后，遵循非指令性原则，与先证者母亲及父亲进行XLHED病例的详细咨询，提供完备且无偏倚的信息后，先证者母亲及父亲均明确表示有避免再次生育XLHED患儿的愿望，遂告知其产前诊断的局限性及具体流程，签署知情同意书，提取先证者、母亲血样进行EDA基因检测。在明确先证者EDA基因突变位点后，详细告知先证者母亲及父亲侵入性产前诊断的各种并发症及风险，签署手术同意书后抽取羊水进行EDA基因检测。

1.2.1 实验室方法1.2.1.1 基因组DNA提取 抽取先证者及母亲静脉血5 ml加入EDTA抗凝管，使用厦门致善核酸自动提取仪提取DNA。抽取胎儿羊水10 ml，使用Qiagen试剂盒进行DNA提取，并置于-20 ℃保存。1.2.1.2 引物设计及合成EDA基因编码区有8个外显子，共编码391个氨基酸。根据文献[3-5]设计8对特异性引物扩增EDA基因编码区的8个外显子，确认引物核酸序列，由深圳华大基因科技服务有限公司合成引物，见表1。

表1 EDA外显子1-9 PCR扩增引物序列

1.2.1.3EDA基因检测 对样本进行常规PCR 扩增，反应总体积为25 μl，内含10×反应缓冲液，200 μmol/dNTP，上下游引物各50 ng，模板DNA100 ng，Taq 聚合酶1U。PCR反应条件: 预变性95 ℃ 5分钟，95 ℃变性30秒，56～60 ℃复性30秒，72 ℃ 延伸30秒，共30个循环，最后72 ℃延伸10分钟。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测确认后，交由深圳华大基因科技服务有限公司纯化后直接测序，测序结果提交PubMed-Blast与数据库基因序列进行比较。

1.2.2 胎儿侵入性产前诊断

1.2.2.1 仪器设备 ALOKA1400 超声仪，3.5 MHz穿刺探头，采用22G 150 mm PTC穿刺针。1.2.2.2 羊膜腔穿刺术 孕妇取仰卧位，常规消毒后，在B超介导下经腹行羊膜腔穿刺提取胎儿羊水10 ml，术程顺利。提取羊水DNA后，进行EDA基因诊断。

2 结 果

检测者DNA使用8 对引物在各自条件下分别扩增出相应产物，基因突变测序结果显示孕妇为EDA基因7号外显子c.871G>A杂合子突变，先证者的EDA基因7号外显子c.871G>A纯合子突变，此位点的鸟嘌呤(G)被腺嘌呤(A)替换，导致EDA基因的第291位氨基酸密码子GGC突变成GAC,导致正常的甘氨酸(Gly)被精氨酸(Arg)替代。胎儿的EDA基因测序结果显示7号外显子c.871G>A纯合子突变，与先证者一样均为XLHED患儿。此突变位点与Gene 数据库公布的人类EDA基因核苷酸序列进行比对分析，结果见图1～3。经过遗传咨询，孕妇及家属要求根据伦理原则终止妊娠，引产出一男性胎儿。

图1 先证者母亲外显子5的871位碱基突变反向测序图

图2 先证者外显子5的871位碱基突变反向测序图

图3 胎儿外显子5的871位碱基突变反向测序图

3 讨 论

3.1 病例分型及遗传方式 外胚层发育不良(ED)分有汗型和无汗型两种。有汗性外胚层发育(hidrotie ectodermal dysplasia，HED) 是一种常染色体遗传疾病，其临床表现为甲发育不良、掌跖角化过度、毛发稀疏或完全缺如等，但汗腺和皮脂腺功能正常[6]。无汗性外胚层发育不良多数为X-连锁无汗性外胚层发育不良(XLHED)，男性发病，女性多为基因携带者，其临床表现主要为无汗、脱发、缺牙三联征[1，2]。本文家系的先证者具有典型临床表现：全身无汗、毛发稀少、无眉、鼻梁塌陷、剧烈运动后烦躁、常不明原因发热、全身皮肤干燥、粗糙、牙齿四颗，结合EDA基因结果及家系分析可临床诊断为XLHED。XLHED为X染色体连锁隐性遗传疾病,传递给男性后代致病,传递给女性后代为杂合携带者,其遗传规律如下：①XLHED男性患者与正常女性结婚，其儿子100%正常，其女儿100%为携带者。②正常男性与XLHED女性携带者结婚，其儿子50%正常，50%为患者；其女儿50%正常，50%为携带者。③XLHED男性患者与XLHED女性携带者结婚，其儿子50%正常，50%发病；其女儿50%为携带者，50%发病。④正常男性与XLHED女性患者结婚，其儿子100%为患者，女儿100%为携带者。本例家系中先证者母亲为EDA基因携带者，先证者父亲无异常，若其夫妻要求继续生育，均需进行遗传方式的咨询及胎儿EDA基因产前诊断。

3.2 病因 XLHED的致病基因EDA定位于Xq12～13.1，其基因主要在外胚层中与角质、毛囊、汗腺等起源相关的细胞中表达，其编码区共有8个外显子，编码的ectodysplasin-A蛋白含有391个氨基酸，为Ⅱ型三聚体单次跨膜蛋白，具有细胞内结构域、跨膜结构域、细胞外结构域、酶裂解结构域、胶原样结构域及肿瘤坏死因子(TNF)同源结构域，在各个结构域编码区均可发现EDA突变，至今报道各类突变已达200多种[7]。本研究中先证者与胎儿的EDA基因7号外显子第871位点的鸟嘌呤(G)被腺嘌呤(A)转换，使EDA基因的第291位氨基酸密码子GGC突变成GAC，使正常的甘氨酸(Gly)被精氨酸(Arg)替代，此突变位于TNF同源结构域，会导致蛋白合成提前终止，从而影响了EDA基因编码的ectodysplasin-A蛋白与相应受体的结合，中断或消弱了正常外胚层上皮细胞信号通路，影响皮肤及其附属物的正常发育[8]。

3.3 产前诊断 XLHED的患者由于汗腺发育不全，散热困难，临床上仅能通过物理方法对症治疗，病死率高，存活至成年者较少[2]，因此该病的产前诊断有重要意义。对有或疑有XLHED家族史的孕妇应进行遗传咨询，需对家族中的先证者、可能的携带者及孕妇进行家系分析及EDA基因诊断，明确家系中EDA突变位点后，方可对其胎儿进行产前诊断。同时需告知遗传异质性，不排除临床表现典型却无法找出相关基因突变位点。除了通过侵入性产前诊断方法获取脐血、羊水、绒毛进行EDA基因产前诊断外，有文献报道可通过提取母亲外周血中游离胎儿细胞进行EDA基因诊断[9]，也有报道在中孕晚期利用胎儿镜行宫内胎儿皮肤活检，取胎儿皮肤进行组织病理学分析[10]。当胎儿经过产前诊断确诊为XLHED患儿时，需遵循知情同意及知情选择原则，向孕妇及家属提供真实、充分的信息，并进行有效的遗传咨询，同时需尊重孕妇及家属的选择。若其要求保留胎儿，应告知其在胎儿出生后需及早采取措施避免或减少高热带来的严重后遗症的危害，并尽早治疗。

本文对1例散发XLHED家系找出EDA基因突变位点并进行产前诊断，通过有效的遗传咨询及产前诊断是预防和减少XLHED患儿出生的有效措施。

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编辑：宋文颖

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中国产前诊断杂志(电子版)编辑部

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