芦丁对脂多糖诱导急性肺损伤小鼠的作用及机制

袁 红，周慧霞，兰秋艳，王晓琴，刘卫名

0 引言

急性肺损伤(Acute lung injury，ALI)是由肺内外因素导致的一种临床危重症。其典型临床表现为进行性呼吸困难和顽固性低氧血症［1-3］。其具体机制不明，故尚无有效的治疗措施。最近研究发现，氧化应激和炎症是导致急性肺损伤的重要发病机制［4-6］。芦丁是一种从植物提取的黄酮类化合物，最近研究发现，其具有抗氧化应激和炎症活性等作用［7-9］。而氧化应激和炎症是急性肺损伤重要发病机制［3-6］。本实验制作脂多糖诱发小鼠急性肺损伤模型，探讨芦丁对急性肺损伤氧化应激和炎症的影响。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 芦丁(哈森，上海)，LPS(Sigma，美国)，3%戊巴比妥钠(桥星，上海)，HE试剂由华西医院病理实验室配制。紫外分光光度计(Thermo fisher)、逆转录仪(eppendorf)、qPCR 仪(BIORAD IQ5)、显微镜(Olympus BX51)及成像系统(HITMAS-30)均为石河子医院病理科实验室临床病理组提供。

1.2 实验动物及分组 30只雄性健康C57小鼠，20～25 g，SPF级，购自北京华富康实验动物中心，质量合格证号:510342011，饲养于石河子医院实验动物实验中心适应性喂养7 d后，状态良好，小鼠随机分为对照组(C组)、脂多糖组(LPS组)和芦丁组(R组)，每组10只，C组和LPS组在LPS前0.5 h给予等量生理盐水腹腔注射，LPS组和R组给予脂多糖(20 mg/kg)腹腔注射，C组给予等浓度生理盐水腹腔注射。剂量参考文献［10-11］。

1.3 标本收集和测血气与干湿比 各组小鼠在LPS注射后6 h，在3%戊巴比妥钠局麻下行腹主动脉取血，取1 mL送石河子医院检验科血气分析，其余室温下3 000 r/min离心10 min后取上清液。开胸取肺脏，1/3肺脏置于多聚甲醛做石蜡切片，1/3肺脏称湿重，80℃恒温箱烤48 h至干重恒定，称干重，计算湿/干比，其余肺组织冻于－80℃冰箱。

1.4 肺脏病理检测 肺脏组织采用10%多聚甲醛固定，常规脱水浸蜡(Thermo Fisher)，石蜡包埋，4 μm切片，脱蜡透明后由病理科实验室PAS试剂进行HE染色，光镜下观察形态结构并按形态评分标准［12］评分。0分(没有损伤);1分(轻度损伤):间质水肿和局限性坏死;2分(中度损伤):广泛的肺脏细胞肿胀和坏死;3分(严重):有血管浓缩和肺脏萎缩的坏死;4分(极严重):弥漫性血管浓缩，出血和肺脏坏死。

1.5 肺组织匀浆中MDA的含量和 CAT、GPx、SOD活性测定 剩余肺组织制备组织匀浆，硫代巴比妥酸(TBA)法测定MDA含量，测定肺组织CAT、GPx和SOD活性，具体步骤按试剂盒说明书进行。

1.6 实时定量 PCR(RT-PCR)检测 TNF-α、IL-6和IL-1β 称取适量肺组织，于液氮中研磨成粉末状提取总RNA，紫外分光光度计测量浓度，逆转录以及扩增反应按试剂盒说明书进行。以管家基因β-actin作为内参对照基因，用得到的各样本的Ct值按公式2－ΔΔCT计算相对表达量。实时定量PCR检测引物序列见表1。

表1 实时定量PCR检测引物序列

1.7 ELISA检测血清中IL-6、TNF-α和IL-1β表达水平 按照ELISA试剂盒说明书操作步骤检测血清中IL-6、TNF-α和IL-1β表达水平。

1.8 统计学方法 采用SPSS 15.0统计软件进行分析，数据以±s表示，各组间差异采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 芦丁预处理对脂多糖诱导的肺组织损伤的影响 与C组比较，LPS组肺组织形态学变化明显增加，表现为肺间质及肺泡腔有大量出血、水肿、渗出、中性粒细胞浸润，毛细血管扩张明显增加，其损伤评分为(8±2)分，而C组为(1±0.5)分。但与LPS组比较，R组肺组织形态学变化明显减少，表现为肺间质及肺泡腔有出血、水肿、渗出、中性粒细胞浸润，毛细血管扩张明显减少，其损伤评分为(3±1)分。结果显示，芦丁预处理可以明显减轻脂多糖对肺组织的损伤。见图1。

图1 芦丁对脂多糖诱发的急性肺损伤病理结构影响(HE染色，200×)注:与C组比较，*P＜0.05;与LPS组比较，#P＜0.05

2.2 芦丁对脂多糖诱导的肺湿/干比(W/D)的影响 LPS刺激6 h后，与C组比较，LPS组肺W/D比值明显增加(P＜0.001);与LPS组比较，芦丁组W/D明显降低(P＜0.01)，显示芦丁预处理可明显减轻脂多糖诱导的肺水肿(P＜0.05)。见图2。

图2 芦丁对脂多糖诱导的肺湿/干比(W/D)的影响注:与C组比较，＊＊＊P＜0.001;与LPS组比较，##P＜0.001

2.3 芦丁对脂多糖诱发的小鼠血气改变的影响

与C组比较，LPS组PaCO2和RR明显增加，而PaO2和pH明显降低(P＜0.01)，但与LPS组比较，R组PaCO2和RR明显降低，而PaO2和pH明显增加(P＜0.05)，说明芦丁预处理可以降低脂多糖诱发的血气改变。见图3。

2.4 芦丁预处理对MDA含量的影响 与C组比较，LPS组MDA含量明显增加(P＜0.01)，与LPS组比较，R组MDA含量明显降低(P＜0.05)，说明芦丁预处理可以减轻脂多糖诱发的氧化应激。见图4。

2.5 芦丁预处理对CAT、GPx和SOD活性的影响 与C组比较，LPS组CAT、GPx和SOD活性明显降低(P＜0.05)，与LPS组比较，R组CAT、GPx和SOD的活性明显降低(P＜0.05)，显示芦丁预处理可以明显减轻CAT、GPx和SOD活性(P＜0.05)。见图5。

图3 芦丁对脂多糖诱发的小鼠血气改变的影响注:与C组比较，*P＜0.01;与LPS组比较，#P＜0.05

图4 芦丁预处理对MDA含量的影响注:与C组比较，＊＊P＜0.01;与LPS组比较，#P＜0.05

图5 芦丁预处理对CAT、GPx和SOD活性的影响注:与C组比较，*P＜0.05;与LPS组比较，#P＜0.05

2.6 芦丁预处理对促炎症细胞因子TNF-α、IL-1β和 IL-6表达的影响 与 C组比较，LPS组TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平明显增加，但芦丁预处理后，与 LPS组比较，R组 TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平明显减少(P＜0.05)，显示芦丁预处理可以明显减少脂多糖诱发的促炎症细胞因子的表达(P＜0.05)。见图6。

3 讨论

研究发现，ALI致病机制为肺血管广泛损伤导致炎症反应和氧化应激的激活，导致肺以及多器官功能受损［3-6］。因此，抑制炎症和氧化应激是减轻急性肺损伤的有效途径之一。

芦丁又称为芸香苷，维生素P，是从芸香叶、烟叶、枣、杏、橙皮、番茄、荞麦花等提取的的一种黄酮类物质，其分子式为C27H30O16［7-9］。因其具有卓越的活血化瘀功效而在临床上广泛用于防治脑出血、高血压、紫癫和急性出血性肾炎等，最近研究发现，芦丁除具有活血化瘀功效外，还具有多重生物学活性如抗炎、抗氧化应激、抗病毒等［7-9］，而炎症和氧化应激是急性肺损伤重要的发病机制［1-4］。实验结果显示，脂多糖可导致小鼠肺间质及肺泡腔广泛出血、水肿、渗出以及中性粒细胞浸润，毛细血管扩张、肺湿/干比和PaCO2和RR明显增加，导致PaO2和pH明显降低，严重影响肺脏的功能，与既往的研究报道一致［3-6］。基于上述的研究和芦丁具有减轻肾脏和肝脏损害的功能［13-14］，我们研究了芦丁对脂多糖诱导的肺损伤作用，结果显示，芦丁预处理可使脂多糖导致的小鼠肺间质及肺泡腔出血、水肿、渗出、中性粒细胞浸润，毛细血管扩张明显减少、肺湿/干比、PaCO2和RR明显降低，而PaO2和pH明显增高。这显示芦丁预处理可明显减轻脂多糖导致的小鼠肺脏结构的改变，以及肺脏功能受损。但芦丁如何减轻脂多糖导致的急性肺损伤的具体机制不明。实验结果显示，脂多糖可导致血清和肺脏中促炎症细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α表达明显增加，肺脏氧化应激标志物脂质过氧化产物MDA含量明显增高，抗氧化应激酶CAT、GPx和SOD活性明显降低［7-9］。进一步证实脂多糖导致炎症和氧化应激是诱导急性肺损伤的重要发病因素，而芦丁预处理可明显减少促炎症细胞因子 IL-6、IL-1β、TNF-α 和脂质过氧化产物MDA含量，明显增加抗氧化应激酶CAT、GPx和SOD活性。说明抗氧化应激和抑制炎症反应是芦丁减轻脂多糖导致的急性肺损伤的重要途径。但在急性肺损伤中，芦丁除干预氧化应激和炎症反应外，是否还有其他途径参与以及芦丁抑制氧化应激和炎症反应的具体信号途径目前仍然不清楚，这将是我们进一步研究解决的问题。本实验提示，芦丁预处理可通过抗氧化应激和炎症反应从而减轻脂多糖导致的急性肺损伤，这为临床预防治疗急性肺损伤提供了新的新思路。

图6 芦丁预处理对促炎症细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达的影响注:与 C 组比较，*P ＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P ＜0.001;与LPS组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

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