培美曲塞联合β-榄香烯对宫颈癌HeLa 细胞增殖和凋亡的影响

白 杨，李 录，马力天，张 毅，毛立挺，马 瑞，任秦有，胡 月，邢劲松，郑 瑾

0 引 言

我国每年宫颈癌新发病例占全球的28.8%［1］。目前，不少中药用于抗肿瘤治疗［2］，榄香烯是从中药温郁金中提取出的国家二类抗肿瘤新药［3］，其中β-榄香烯具有较好的抗肿瘤作用。其抗肿瘤效果明确且不发生骨髓抑制［4］。将β-榄香烯引入到传统化疗方案中可能会取得更好的效果并减轻患者痛苦。本实验使用β-榄香烯联合培美曲塞对宫颈癌HeLa 细胞进行体外实验，探讨联合用药的可行性，为临床制订化疗方案提供参考。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 β-榄香烯(大连华立金药业有限公司)，MTT(购自晶彩生物有限公司)，培美曲塞二钠(Ei Lilly and Company)、DMEM 高糖培养基(Thermofisher)、四季青胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)。HeLa 细胞(第四军医大学放射医学教研室)，流式细胞仪(美国Bection Dickinson 公司)。

1.2 HeLa 细胞的培养及传代 用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、1% L-谷氨酰胺的DMEM 培养基将HeLa 细胞培养于37 ℃、5%CO2的细胞孵箱中，每天换液1 次。在倒置显微镜下观察细胞密度为80%～90%时，以胰酶37 ℃消化2 ～3 min 传代。

1.3 药物浓度的选择 按照文献［5］的方法选择药物浓度，公式如下:

S=0.006 1H+0.012 4W－0.009 9

S 为体表面积(m2);H 为身高(cm);W 为体重(kg)。培美曲塞的临床推荐化疗剂量为500 mg/m2，计算50 kg 患者体内药物浓度为82.355 μg/mL，因此我们培美曲塞的浓度梯度为38、76、152、228、304 μg/mL。

1.4 MTT 法检测HeLa 细胞的增殖情况 对数生长期的HeLa 细胞，以离心半径13 cm、1000 r/min离心5 min，用高糖DMEM(含10%胎牛血清)将细胞浓度调为1×105个/mL 细胞悬液后，接种于96 孔培养板，加细胞悬液100 μL/孔，置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中，细胞贴壁长到60%～70%后，更换培养基，并且每孔分别加入培美曲塞(溶于PBS 中)，使终浓度达到38、76、152、228、304 μg/mL。每个浓度设4 个复孔，另设空白对照(0 μg/mL)。单独作用24、48 h，每孔加20 μL MTT，于37 ℃、5%CO2培育箱中孵育4 h 后取出并将含MTT 的细胞培养基吸出(注意不要吸掉孔底的MTT 结晶)，于微量振荡器上振荡5 min，用酶联免疫检测仪处测量各孔的A490。实验重复3 次，取均值计算增殖抑制率。公式如下:

增殖抑制率=(1－药物组A 值/对照组A 值)×100%

1.5 联合用药浓度的选择 根据增殖曲线，结合临床上使用培美曲塞和β-榄香烯［6］的不同剂量和最大耐受量，我们选择培美曲塞的最适浓度为76 μg/mL，β-榄香烯的最适浓度为125 μg/mL。

1.6 MTT 法检测培美曲塞联合β-榄香烯对HeLa细胞的增殖情况 共分4 组，β-榄香烯组(125 μg/mL)、培美曲塞组(76 μg/mL)、联合用药组(培美曲塞组76 μg/mL、β-榄香烯组125 μg/mL)、空白对照组0 μg/mL，作用24 h。每个浓度设4 个复孔。实验重复3 次，取均值计算增殖抑制率。

1.7 流式细胞术检测联合用药时细胞的凋亡情况取对数生长期的HeLa 细胞，以离心半径13 cm、1000 r/min 离心5 min，用高糖DMEM(含10%胎牛血清)将细胞浓度调为1×106个/mL 细胞悬液后，接种于6孔板。4 组每孔加细胞悬液2 mL，放在37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中，细胞贴壁长到70%～80%后，按照不同组别分别加入培美曲塞和β-榄香烯。

收集加药后24h 的细胞培养基和贴壁细胞(悬浮细胞直接收集到离心管中，贴壁细胞用胰酶消化)，细胞数不少于5×105个，收集细胞后以离心半径13 cm、1000 r/min 离心5 min，根据Annexin V-FITC/PI双标记试剂盒说明，取195 μL 细胞悬液，加入5 μL Annexin V-FITC 混匀，室温反应10 min，PBS 洗细胞1次，在以190 μL 稀释的结合缓冲液重悬，加10 μL 碘化丙啶染色液，轻轻混匀，随即用流式细胞仪分析。流式细胞仪分析采集软件:BD FACSDiva Software。使用两药相互作用系数(CDI)评价两药相互作用性质［7］:

CDI=E/(A×B)

E 是两药联合组与对照组吸光度比值，A 或B是各单药组与对照组吸光度的比值。如果CDI ＜1，则两药作用性质为协同;如果CDI=1，则两药作用性质为相加;如果CDI ＞1，则两药作用性质为拮抗。

1.8 统计学分析 采用SPSS 19.0 软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差)表示，两组均数的比较采用t 检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，以P≤0.05 为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 培美曲塞对HeLa 细胞增殖的影响 MTT 结果显示38、76、152、228、304 μg/mL 浓度梯度范围内，培美曲塞对HeLa 细胞有抑制作用，随浓度上升，抑制作用增强。38、76、152、228 μg/mL 培美曲塞作用24 h时，对HeLa 细胞增殖抑制率两两比较差异有统计学意义(P ＜0.05)，228 μg/mL 培美曲塞与304 μg/mL培美曲塞抑制率差异无统计学意义(P ＞0.05);38、76、152 μg/mL 培美曲塞作用48 h 时，对HeLa 细胞增殖抑制率两两比较差异有统计学意义(P ＜0.05)。与152 μg/mL 培美曲塞比，228、304 μg/mL 培美曲塞48 h抑制率差异无统计学意义(P ＞0.05);同一浓度，作用24 h 与48 h 对HeLa细胞增殖抑制率差异均有统计学意义(P ＜0.05)。见表1。

2.2 培美曲塞联合β-榄香烯对HeLa 细胞增殖的影响 MTT 法结果显示联合用药组24 h 抑制率［(49.94±6.60)%］高于单独使用β-榄香烯［(24.35±4.49)%］和培美曲塞［(10.69±4.80)%］，差异有统计学意义(P ＜0.01)。联合作用24 h 后，其两药相互作用系数(CDI)=0.74 ＜1，即联合使用可协同抑制HeLa 细胞的增殖。

2.3 联合用药对HeLa 细胞凋亡的影响 膜联蛋白V(Annexin-V)是一种依赖性的磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)高亲和力特异性结合。利用Annexin-V 易与凋亡早期细胞膜表面PS 结合的特性，将AnnexinV 标记荧光来检测早期凋亡的细胞。与单独用药组相比，24 h 联合用药组可以使大部分细胞发生凋亡。见图1。

表1 培美曲塞对HeLa 细胞增殖的影响，%)Table 1 Effect of pemetrexed on the proliferation of HeLa cell

表1 培美曲塞对HeLa 细胞增殖的影响，%)Table 1 Effect of pemetrexed on the proliferation of HeLa cell

与同浓度作用24 h 时比较，*P ＜0.05

培美曲塞浓度(μg/mL) n 24 h HeLa细胞增殖抑制率48 h 38 4 7.24±3.78 16.69±0.95*76 4 7.94±4.37 22.54±1.53*152 4 11.10±2.86 24.48±0.92*228 4 15.88±3.38 25.54±3.61*304 4 16.52±2.54 26.08±1.47*

图1 培美曲塞联合榄香烯作用24 h 后HeLa 细胞的凋亡情况Figure 1 Apoptosis of HeLa cells treated by β-Elemene combined with Pemetrexed in 24 h

3 讨 论

宫颈癌的病因可能与以下因素有关:人乳头瘤病毒感染［8－10］、性行为、产次［1］、其他病原体感染［11］和一些协同因素，比如吸烟。宫颈癌的治疗主要包括手术及放射治疗，过去认为宫颈癌属于化疗不敏感肿瘤，但近年来，化疗已成为辅助治疗的常用方法［12］。

培美曲塞是一种常用的化疗药和多靶点的抗代谢类药物［13－14］，可通过抑制合成碱基的相关叶酸依赖酶系，干扰DNA 及RNA 的合成来抑制肿瘤细胞生长［15］。例如，培美曲塞可通过抑制胸苷酸合成酶的合成，使DNA 合成所必须的可利用的胸腺嘧啶减少，从而造成细胞增殖下降，特别是在快速增殖的肿瘤细胞中［16］。培美曲塞主要用于治疗不宜手术的恶性胸腹膜间皮瘤［17］，也可用于其他一些肿瘤，包括宫颈癌、胃癌、胰腺癌等［18］。在使用培美曲塞时会出现一定的骨髓抑制［19］、过敏、腹泻等不良反应。

β-榄香烯具有较好的抗肿瘤作用，可抑制肝癌HepG2 细 胞［20－21］、胶 质 瘤［22］等 肿 瘤 细 胞 增 殖。β-榄香烯抗肿瘤的机制复杂，例如，直接细胞毒作用、诱导肿瘤细胞凋亡、影响癌细胞核酸代谢、增强机体免疫、瘤苗主动免疫和影响癌细胞膜电位［23］;另外，还可通过扭转上皮间质转化和多药耐药以及诱导细胞自噬起到抗肿瘤的作用［24］，且在用药过程中不发生骨髓抑制，而且还会改善化疗药物所致的骨髓抑制等不良反应［25］。

本文通过β-榄香烯联合培美曲塞联合使用，以体外培养的HeLa 细胞为模型，利用MTT、流式细胞术检测β-榄香烯联合培美曲塞联合使用对HeLa 细胞增殖和凋亡的作用。MTT 结果显示，当两药联合应用时，联合用药组24 h 抑制率要显著高于单独使用β-榄香烯和培美曲塞组，流式细胞术结果也发现β-榄香烯联合培美曲塞可以协同促进HeLa 细胞凋亡。这提示我们，β-榄香烯和培美曲塞联合治疗宫颈癌时，不但抗癌作用明显，且β-榄香烯和培美曲塞联合能起到增效减毒的作用。

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