唾液及血浆中微小RNA-21水平应用于早期食管癌的诊断价值

李 伟,闫丛临,谭晓刚

(1.河南省南阳市中心医院胸外科 473009;2.中国医学科学院肿瘤医院胸外科，北京 100021)

唾液及血浆中微小RNA-21水平应用于早期食管癌的诊断价值

李 伟1,闫丛临1,谭晓刚2

(1.河南省南阳市中心医院胸外科 473009;2.中国医学科学院肿瘤医院胸外科，北京 100021)

目的 研究唾液及血浆中的微小RNA-21(miRNA-21)水平应用于早期食管癌的诊断价值。方法 选取2011年2月至2014年2月河南省南阳市中心医院收治的112例早期食管癌患者作为观察组，同期来该院进行健康查体的100例患者作为对照组，比较两组查体者miRNA-21的表达水平，比较唾液和血浆miRNA-21的诊断价值；研究miRNA-21水平与肿瘤分期、病理类型和分化的相关性。结果 观察组唾液miRNA-21水平为(6.08±2.22)，对照组为(0.64±0.09)，差异有统计学意义(P<0.05)；观察组的血浆miRNA-21表达水平为(20.91±10.59)，对照组为(1.69±0.17)，差异有统计学意义(P<0.05)。唾液中的miRNA-21水平ROC曲线下面积(AUC)为0.866 5，灵敏度为88.24%，特异度为69.97%；血浆中的miRNA-21 AUC为0.882 0，灵敏度为90.20%，特异度为70.69%，二者诊断价值差异无统计学意义(P>0.05)。唾液与血浆中的miRNA-21水平与早期食管癌的分期和病理类型无明显的相关性(P>0.05)，与分化程度相关性较强(P<0.05)。结论 唾液及血浆中的miRNA-21水平应用于早期食管癌具有较高的诊断价值，唾液可能代替血浆应用于早期食管癌的诊断。

唾液；血浆；微小RNA-21；食管肿瘤；诊断价值

食管癌是常见的消化系统恶性肿瘤。中国是该疾病的高发地区之一，其发生率和病死率高居第4位。在我国，每年约15万人死于食管癌[1]。早期食管癌症状多不典型，主要表现为吞咽粗硬食物时的不适感，故多数患者就诊时已经处于肿瘤的中晚期，治疗效果和预后均不理想。因此，早期的诊断和干预对食管癌患者的意义重大。大量研究表明，微小RNA-21(miRNA-21)的表达水平与食管癌相关性较高[2]。同时，唾液含有多种血液中的分子物质[3]，故本次研究选取112例食管癌患者作为研究对象，探讨唾液及血浆中的miRNA-21水平在早期食管癌诊断中的应价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2011年2月至2014年2月河南省南阳市中心医院收治的112例早期食管癌患者作为观察组，其中男65例，女47例，年龄38～72岁，平均(54.2±14.3)岁。112例患者均行吞钡X线食管摄片和纤维食管镜检查确诊，TNM分期如下：Ⅰ期61例，Ⅱ期51例；鳞癌83例，非鳞癌29例；高分化72例，中分化27例，低分化13例。选取同一时期来该院进行健康查体的100例查体者作为对照组，其中男52例，女48例，年龄38～72岁，平均(54.2±14.3)岁。两组研究对象的性别和年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有研究对象均签署知情同意书，研究符合医学伦理学原则。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 所有研究对象均禁饮食10 h，于上午7:00左右在门诊或病房采外周静脉血4 mL，并将血液放置于外周抗凝管。在收集唾液前，需要禁口腔清洁，用柠檬酸湿润过的无菌棉签刺激研究对象舌头一侧，以增加唾液量，使用59 mL的无菌无酶离心管收集唾液，反复操作，保证收集的唾液大于或等于3 mL。将收集到的样本，在4 ℃的离心机中离心15 min，转速为3 000 g，收集上清液置于EP管中，再以12 000 g的速度在4 ℃下离心10 min，将上清液置于-80 ℃的冰箱中保存。

1.2.2 唾液及血浆中的miRNA-21水平检测 应用Ambion公司生产的mirVana PARIS Kit试剂盒对唾液和血浆中的总RNA-21进行提取。DNA模板5 μL，PCR缓冲液2 μL，dNTP 2 μL，MgCl22 μL，引物1(upward，上海生物工程公司)0.5 μL，引物2(downward，上海生物工程公司)0.5 μL，dH2O 7.75 μL，Tag 0.25 μL，共20 μL配成反应体系。反转录条件：94 ℃变性5 min，94 ℃ 1 min，5 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，顺序循环35次，72 ℃延伸5 min，产物于4 ℃保存。扩增方法如下：取3 μL反转产物作为模板，用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒(TaKaRa公司)进行扩增，所有反应均同时用3个复孔，循环50次，扩增条件为95 ℃ 2 min，然后95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s。内参选择miR-16。溶解曲线：65.0～95.0 ℃，increment 0.5 ℃ for 0.05 min+plate read。采用Biorad公司的CFX962.1实时定量PCR仪进行检测。miRNA-21的表达量采用2-ΔΔCt表示[4]。

2 结 果

2.1 两组研究对象唾液和血浆miRNA-21水平比较 观察组唾液miRNA-21水平为(6.08±2.22)，对照组唾液miRNA-21水平为(0.64±0.09)，差异有统计学意义(t=4.982，P<0.05)；观察组的血浆miRNA-21表达水平为(20.91±10.59)，对照组血浆miRNA-21表达水平为(1.69±0.17)，差异有统计学意义(t=5.113，P<0.05)。

2.2 唾液与血浆中miRNA-21水平的诊断价值比较 针对唾液中的miRNA-21水平构建ROC曲线下面积(AUC)为0.866 5，血浆miRNA-21水平诊断早期食管癌的灵敏度为88.24%，特异度为69.97%(图1A)。针对血浆中的miRNA-21水平构建ROC曲线，AUC为0.882 0，血浆miRNA-21水平诊断早期食管癌的灵敏度为90.20%，特异度为70.69%(图1B)。唾液与血浆中的miRNA-21水平的诊断价值差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 唾液与血浆中的miRNA-21水平与早期食管癌的分期、病理类型及分化的相关性 唾液与血浆中的miRNA-21水平与早期食管癌的分期和病理类型无明显的相关性(P>0.05)，与分化程度相关性较强(P<0.05)，见表1。

A：唾液;B:血浆。

图1 miRNA-21水平的ROC曲线

3 讨 论

食管癌是我国较为常见的恶性肿瘤，男性发病率高于女性，它的发生与多种因素有关，包括遗传因素、不良饮食习惯、抽烟、酗酒[5]。食管癌患者的早期症状多不明显，且临床上缺乏有效的诊断手段，给疾病的诊断带来一定的困难，延误治疗。

研究中，112例早期食管癌患者的唾液miRNA-21水平较正常人群唾液平均上调超过10.5倍；患者血浆miRNA-21水平较正常人群血浆miRNA-21表达水平平均上调了15.3倍，这表明，与健康人群相比，早期食管癌的患者miRNA-21的水平明显增加。这一结果与叶敏华等[6]的结果较为一致。恶性肿瘤是由细胞增殖和分化的调控机制异常，导致细胞增殖失控而引起的疾病[7]。正常细胞内存在多种抑癌基因和原癌基因，这些基因的突变和异常表达都可以导致细胞的增殖、分化和凋亡过程失控，形成肿瘤[8]。miRNA是一类非编码的内源性的RNA序列，研究表明，它可以通过调控相应mRNA的翻译和降解过程来调节特定基因的表达水平，从而参与细胞的增殖、分化和凋亡过程的调节[9-10]。研究发现多种miRNA与食管癌的发生、发展和预后具有一定的相关性：miR-21，它通过与细胞程序性死亡蛋白4(PDCD4) mRNA相结合，抑制了PDCD4的翻译过程，增加了食管癌的发生风险[11]。刘清等[12]利用脂质体介导的细胞转染方法将miRNA-21抑制剂转入食管鳞癌细胞Ecal09中，转染后细胞的miRNA-21水平明显下降，而PDCD4明显上升，组织水平上miRNA-21与PDCD4呈负相关。因此miRNA-21水平在早期食管癌的诊断中具有一定的价值。本研究同时对患者唾液和血浆中的miR-21水平及其诊断价值进行比较，唾液中的miRNA-21水平AUC为0.866 5，灵敏度为88.24%，特异度为69.97%；血浆中的miRNA-21 AUC为0.882 0，灵敏度为90.20%，特异度为70.69%，二者均具有较高的诊断价值。唾液腺的血流丰富，唾液中含有与血浆非常相似的分子物质，如蛋白质和核酸。血浆中的蛋白质、DNA和RNA通过水通道、直接扩散和细胞间隙进入唾液腺并分泌到唾液中，故唾液可以作为血浆的代替品，反应机体内的分子动态变化[13]。研究认为，肿瘤组织释放的多种介质可以通过脉管系统对远端的唾液腺等器官的生物功能进行调控，增加或减少唾液中的蛋白质、DNA和RNA的释放。故唾液中miRNA-21的诊断价值与血浆miRNA-21相当。检测血浆的mi-RNA水平需要进行有创操作，故需要有经验的人员进行操作。唾液中的mi-RNA水平检测是无创性操作，但是影响因素较多，且唾液中含有多种酶类，可能影响结果的准确性。miRNA-21的稳定性较差，故应该严格按照流程操作，注意样本的保存。

本次研究中，miRNA-21的水平与早期食管癌的病理分期和类型无明显的相关性，与食管癌的分化程度相关性较强。Ⅰ期和Ⅱ期食管癌均属于早期食管癌，差异并不明确；食管癌的分化程度是食管癌预后的重要不良因素，与miRNA-21水平的相关性较强，提示miRNA-21也可以作为预后判断的指标。

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Diagnostic value of application of salivary and plasma microRNA-21 in early esophageal cancer*

LiWei1,YanConglin1,TanXiaogang2

(1.DepartmentofThoracicSurgery,NanyangMunicipalCentralHospital,Nanyang,Henan473009,China;2.DepartmentofThoracicSurgery,TumorHospitalofChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing100021,China)

Objective To study the diagnostic values of salivary and plasma microRNA-21 for e early esophageal cancer.Methods Totally 112 patients with early esophageal cancer in Nanyang Municipal Central Hospital from February 2011 to February 2014 were selected as the observation group and contemporaneous 100 healthy people of physical examination were selected as the contract group.The salivary and plasma microRNA-21 expression levels were compared between the two groups;the diagnostic values of salivary versus plasma microRNA-21 for the early esophageal cancer were also compared;the correlation between the miRNA-21 level with the stage,pathogenic type and differentiation of early esophageal cancer.Results The salivary microRNA-21 level (6.08±2.22) in the observation group and (0.64±0.09) in the control group,the difference had statistical significance (P<0.05);the plasma microRNA-21 level in the observation group was (20.91±10.59) and (1.69±0.17) in the constract group,the difference had statistical significance (P<0.05).The area underROC curve(AUC) of salivary microRNA-21 level was 0.866 5,the sensitivity was 88.24%,the specificity was 69.97%;while AUC of plasma microRNA-21 level was 0.882 0,the sensitivity was 90.20%,the specificity was 70.69%,the differences in the diagnostic value had no statistical significance between them(P>0.05).The salivary and plasma microRNA-21 levels had no obvious correlation with the stage and pathogenic type of early esophageal cancer(P>0.05),while had strong correlation with the differentiation degree(P<0.05).Conclusion Salivary and plasma microRNA-21 has higher diagnostic value in for early esophageal cancer,and saliva may supplant plasma in the diagnosis of early esophageal cancer.

saliva;plasma;microRNA-21;esophageal neoplasms;diagnostic value

国家自然科学基金资助项目(81101773)。 作者简介：李伟(1968-)，本科，副主任医师，主要从事胸外科工作。

·临床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.14.008

R735.1

A

1671-8348(2015)14-1894-03

2015-01-10

2015-02-26)