循环肿瘤细胞与膀胱癌临床病理特征的相关性研究

白云金，唐 寅，韩 平，李 响，李 虹，魏 强

(四川大学华西医院泌尿外科，四川成都 610041)

·临床研究·

循环肿瘤细胞与膀胱癌临床病理特征的相关性研究

白云金，唐 寅，韩 平，李 响，李 虹，魏 强

(四川大学华西医院泌尿外科，四川成都 610041)

目的 探讨循环肿瘤细胞(CTC)与膀胱癌患者临床病理特征之间的相关性。方法 采集78例膀胱癌患者(膀胱癌组)和10例同期非肿瘤患者(对照组)外周静脉血，运用流式细胞术检测CD45表达阴性且CK8/18/19表达阳性的CTC，分析CTC与膀胱癌患者临床病理特征的相关性。结果 78例膀胱癌CTC阳性率为34.6%(27/78)，对照组均未检出CTC，两组CTC检出率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；膀胱癌CTC阳性率与肿瘤大小、数目、T分期以及病理分级有关(P<0.05)；多因素Logistic回归分析显示，CTC阳性率与肿瘤大小、T分期和病理分级有关(P<0.05)。 CTC阳性率肿瘤直径≥3 cm者为51.52%(17/33)，<3 cm者为22.22%(10/45)；肌层浸润者为59.09%(13/22)，非肌层浸润者为25%(14/56)；病理高分级者为52%(13/25)，低分级阳性率为26.42%(14/53)。结论 CTC 与膀胱癌患者肿瘤大小、浸润深度和病理分级具有相关性。

膀胱肿瘤；循环肿瘤细胞；临床病理特征；流式细胞术

膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，在我国其发病率和死亡率均居泌尿系肿瘤的首位[1-2]。对于肌层浸润性膀胱癌，根治术后5年生存率为26%～64%，多数患者死于肿瘤转移[2-4]。因此，对行根治手术者需进一步分层和动态监测，并适当选择多模式治疗措施，以提高膀胱癌生存率。血行播散是膀胱癌远处转移的重要途径之一，而外周血中循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTC)的存在是血行播散的表现。研究证实CTC与多种肿瘤的复发和转移密切相关，包括乳腺癌、直肠癌和前列腺癌等[5]。本研究旨在运用多标志物联合的流式细胞术检测膀胱癌患者的CTC，分析其与患者临床病理特征的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集华西医院2014年10月至2015年1月病理证实为膀胱癌患者78例(皆无其他恶性肿瘤病史且未接受任何抗肿瘤治疗)，其中男58例，女20例；年龄42～80岁，平均(66.14±9.94)岁；单纯尿路上皮癌67例，尿路上皮癌合并腺样或鳞状分化9例，尿路上皮癌合并小细胞神经内分泌癌1例，鳞状细胞癌1例；肿瘤直径<3 cm 45例，直径≥3 cm 33例；单发54例，多发24例；非肌层浸润56例，肌层浸润22例；根据WHO 2004年膀胱肿瘤组织学分级，低级别癌53例，高级别癌25例。另收集10例非肿瘤患者作为对照组，其中结石患者6例、肾盂输尿管连接处狭窄3例、精索静脉曲张1例。

1.2 CTC检测方法 应用EDTA抗凝真空采血管采集患者术前肘正中静脉血4 mL(弃穿刺后的前2 mL，4 h内处理)。在离心管中加入4 mL人淋巴细胞分离液，将等量PBS液稀释后的静脉血贴壁缓慢加入人淋巴结细胞分离液上层。水平离心机4℃下2 000 r/min离心15 min。可见离心管自下而上出现5 层，分别为红细胞层、粒细胞层、透明分离液层、白色云雾状单个核细胞层和血浆层，吸取单个核细胞层，PBS液洗涤离心2次(若有红细胞则加红细胞裂解液)。加入500 μL预冷(4 ℃)固定液，避光孵育10 min；PBS液洗涤离心，重悬细胞后加入Anti-CD45-PE-Cy7 10 μL(购自美国BD公司)，4 ℃下避光孵育20 min； PBS液洗涤离心，再加入1 mL破膜剂混匀，4 ℃下避光孵育2 min；PBS液洗涤离心，加入10 μL Anti-CK8/18/19-FITC(购自德国美天旎公司)混匀，4 ℃下避光孵育20 min；PBS液洗涤离心弃上清，加1%多聚甲醛500 μL，固定3 min，洗涤离心2次，重悬细胞至300 μL后放置4 ℃冰箱避光保存，以备流式细胞术检测(FC500MCL/MPL流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司)。每例样本在流式细胞仪上检测(1～2)×106个细胞，结果以外周血每106单个核细胞中 CD45(-)CK8/18/19(+) 细胞数来表示外周血中CTC数量。

1.3 统计学方法 应用SPSS 19.0统计分析软件进行统计学处理。计数资料以频数表示，采用2检验或Fisher确切概率法检验，多因素分析采用Logistic回归分析。均采用双侧检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

对照组中均未检出CTC，膀胱癌组中27例检出CTC，阳性率为34.6%(27/78)，CTC数值为1～104个，其中7例患者 CTC为1个，54例患者CTC数为2～10个，中位数6个，两组CTC阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)。

单因素分析(表 1)，肿瘤直径≥3 cm患者CTC阳性率较肿瘤直径<3 cm患者高(51.52%vs. 22.22%，P<0.05)；肿瘤多发者CTC阳性率较单发者高(50.00%vs. 27.78%，P<0.05)；肿瘤病理高分级患者CTC阳性率较低分级患者高(52.00%vs. 26.42%，P<0.05)；肌层浸润性膀胱癌CTC阳性率明显高于非肌层浸润性膀胱癌(59.09%vs. 25.00%，P<0.05)。而年龄、性别、吸烟史、有无肾积水以及肿瘤组织学类型之间，CTC阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。Logistic多因素回归分析表明，膀胱癌患者CTC阳性率与患者年龄、性别、吸烟史以及肿瘤病理类型临床分期均无明显相关性(P>0.05)，而与肿瘤大小、T分期和病理分级有密切关系(P<0.05)。

表1 CTC阳性与膀胱癌患者临床病理特征的相关性 [例(%)]

续表1 CTC阳性与膀胱癌患者临床病理特征的相关性 [例(%)]

*连续校正；#：尿路上皮癌伴鳞状或腺样分化或合并小细胞神经内分泌癌和鳞状细胞癌。

3 讨 论

膀胱肿瘤细胞的侵袭和转移是影响患者预后的重要因素。文献报道，非肌层浸润性膀胱癌电切术后1年复发率约10%～28%[6-8]，所有患者中将有10%～20%进展为肌层浸润性膀胱癌[9]；根治性膀胱切除术仍是高危非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌的标准术式，但根治术后5年复发率为20%，其中有高达50%患者将形成远处转移灶或死于膀胱癌，其主要原因在于手术前已存在微转移灶[10]。研究证实约50%初治肌层浸润性膀胱癌患者可能已存在微转移[11]。然而，传统影像学并不能早期发现小体积转移灶。因此，临床急需寻找能准确检测微转移灶和预测复发的新手段，这将有助于指导治疗策略的选择，对于高危患者可选择多模式联合治疗，对于局部治疗可治愈的患者可避免全身系统治疗的毒副作用。

CTC是自发或因诊疗操作由肿瘤原发部位进入外周循环中的肿瘤细胞，其在肿瘤确诊、治疗决策、监控辅助治疗疗效和识别被掩蔽的微转移灶有很重要的作用。荟萃分析证实CTC的检测不仅可作为膀胱癌的诊断依据，还可作为浸润性膀胱癌鉴定指标，能提示术前临床分期过低(≤Ⅱ期的患者可能为Ⅲ-Ⅳ期)[12]。与传统诊断手段相比，CTC数量的改变先于影像学检查的改变[13]，因此可作为微转移灶形成早期的监控和检测手段。RINK等[10]运用CellSearch系统检测100例局限性膀胱癌患者的外周血CTC，结果显示手术前外周血CTC阳性率为23%(23/100)，平均随访16月，CTC阳性患者较阴性患者具有更高的复发风险(52%vs.13%，P<0.05)，多因素分析显示，CTC的状态是膀胱癌患者肿瘤复发(HR=4.60，P<0.001)和肿瘤特异生存(HR=5.22，P=0.002)的独立预测指标。FLAIG等[14]发现在转移膀胱癌患者中CTC阳性率为50%(7/14)，中位随访337 d， 7例CTC阳性者全部死亡，而7例CTC阴性患者3例(43%)死亡，研究提示CTC阳性转移性尿路上皮癌患者具有更短的生存期。

目前检测CTC常用的方法是CellSearch系统、免疫细胞化学、流式细胞术及RT-PCR等，CellSearch系统是目前唯一通过美国食品药品管理局认证可用于乳腺癌、结肠癌和前列腺癌CTC 检测的方法，但其价格昂贵，临床较难普及；免疫细胞化学检测细胞数少，检出率低；RT-PCR具有较高的假阳性率。而流式细胞术是利用荧光标记相应抗体检测CTC，该法敏感度较低(10-6，即外周血每106个细胞含1个 CTC即可检出)，只能间接反映肿瘤患者外周血液CTC的数量，且该法需固定细胞将影响后期研究(如细胞培养、细胞生物学行为等)；其优点在于特异性强、重复性好，费用较低、操作简便、快速、数据精确，适用临床普查。

本研究采用流式细胞术检测78例膀胱癌患者外周血CTC，结果显示CTC检出率为34.6%。我们还分析了外周血CTC与膀胱癌临床病理特征的相关性，结果显示膀胱癌CTC阳性率与肿瘤大小、数目、T分期以及病理分级相关(P<0.05)，多因素分析显示，CTC阳性与肿瘤大小、T分期和病理分级相关(P<0.05)。虽然在外周血液中检测到CTC并不意味着必定形成转移灶，但可提示肿瘤浸润性强，复发、转移几率大[15]。因此，CTC的检测有助于及早确定转移复发高危人群，对临床医师准确判断预后和病情具有重要指导作用。动态监测患者CTC变化，有利于及早发现复发转移、及时评估疗效及预后，为患者选择合理化及个体化治疗方案提供依据。本研究仅初步探讨了CTC与膀胱癌患者临床病理特征之间的关系，未来的研究将通过长期随访，进一步阐述CTC与膀胱癌患者预后的关系，并对CTC在膀胱癌综合治疗中的应用价值进行深入探讨。

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(编辑 何宏灵)

Association between circulating tumor cells and clinicopathologic characteristics of bladder cancer

BAI Yun-jin, TANG Yin, HAN Ping, LI Xiang, LI Hong, WEI Qiang

(Department of Urology,West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

Objective To investigate the association between circulating tumor cells (CTCs) and clinicopathologic characteristics of bladder cancer. Methods The peripheral venous blood samples were collected from 78 patients with bladder cancer and 10 patients with non-tumor diseases. CTCs in the samples were detected with flow cytometry with anti-CD45 antibody and anti-CK8/18/19 antibody. The association between CTC and clinicopathologic characteristics of tumors was analyzed. Results The positive rate of CTCs in bladder cancer was 34.6% (27/78), while CTCs were not detected in any non-tumor patients. The positive rate of CTCs in peripheral blood was correlated with tumor size, number of tumor, T stage, and pathological grade. In multivariate analysis, positive CTCs showed correlation with tumor size, T stage, and pathological grade (P<0.05). Conclusion The positive rate CTCs is significantly correlated with the diameter, T stage, and pathological grade of bladder tumor.

bladder neoplasms; circulating tumor cells; clinicopathological characteristics; flow cytometry

2015-03-10

2015-05-24

国家自然科学基金(No.81270841)；四川省科技厅科技支撑计划(No.2013SZ0034)

韩平. E-mail:hanpinghxyy@163.com

白云金(1989-)，男(汉族)，硕士.研究方向：膀胱肿瘤.E-mail：baiyunjin@163.com

R737

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015.09.003