白杨素含膦（磷）衍生物对白血病细胞的增殖抑制作用

扶云碧 刘志和 彭爱云

黄酮类化合物广泛存在于自然界的某些植物和浆果中，是药用植物中的主要活性成分之一，亦是人类饮食中的重要组成部分。黄酮类化合物以其广谱的药理作用尤其是抗肿瘤作用引人瞩目[1-3]。近年来世界上掀起了黄酮类化合物开发的热潮。白杨素（chrysin）是被广泛研究的黄酮类化合物之一，其来源于紫葳科植物木蝴蝶的种子、茎皮，松科植物山白松的心木，芒松的心木等，在蜂胶中的含量较高，是蜂胶的主要有效成分。白杨素的化学名为5，7-二羟基黄酮。研究证明，白杨素具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗高血压、抗糖尿病、抗菌、抗过敏等多种药理作用[4]。本研究旨在探讨新合成的一类膦（磷）酰化白杨素衍生物在体外对白血病细胞的增殖抑制作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 Kasumi-1细胞株、K562细胞株、HL60细胞株、Jurkat细胞株、NB4细胞株及U937细胞株购中国科学院上海细胞库，白杨素含膦（磷）衍生物由中山大学化学与化学工程学院彭爱云提供。PRMI-1640培养基购自美国Gibco公司，新生牛血清从杭州四季青生物工程材料有限公司购买，甲基亚砜（DMSO）购自美国Amresco公司。

1.2 白杨素含膦（磷）衍生物的合成 以白杨素为先导化合物，按步骤1和步骤2所示的合成路线（图1），经膦（磷）酰化结构修饰后合成新的系列白杨素含膦（磷）衍生物。结构经核磁、红外、质谱等确证，纯度经高效液相色谱鉴定。化合物合成由中山大学化学与化学工程学院合成。

1.3 细胞培养及原代细胞分离 细胞株用含10%小牛血清的RPMI 1640完全培养基，加1×105U/L青霉素、1×105U/L链霉素，在37 ℃、95%饱和湿度和5% CO2条件下培养，1~2 d换液1次。

选取根据MIC分型诊断为急性白血病的初诊患者，抽取骨髓5 mL，分离单个核细胞（BMMNCs）。共分离10例急性白血病患者的BMMNCs。

1.4 MTT实验 取指数生长期细胞或BMMNCs，实验在96孔培养板中进行，每孔加入100 μL细胞悬液（2×104个细胞），100 μL用培养基稀释的药物。白杨素为阳性对照组、设溶媒对照组及调零组，每组3孔，培养一定时间后，实验组及对照组每孔加入20 μL MTT液（5 g/L），调零组加入无血清PRMI-1640培养基，混匀，继续培养6 h，离心去清液，每孔加入100 μL DMSO溶液，EX-800型酶标仪以450 nm波长测定OD值，计算相对细胞活力，细胞活力（%）=实验组OD值/对照组OD值×100%，重复3次实验。

图1 白杨素含膦（磷）衍生物的合成

1.5 统计学处理 使用SPSS 11.5软件进行统计学分析，计量资料数据以（±s）表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白杨素含膦（磷）衍生物的结构及理化性质 合成了12个白杨素膦酸单酯（3a–3l），6个白杨素膦酸（4a–4f），1个白杨素膦（磷）酸6和2个白杨素膦（磷）酸单酯7a，7b，共21个化合物。结构见图2。该类化合物是未见文献报道的新化合物，其构效关系显示有更强的抗肿瘤活性、较好的水溶性、更高的生物利用度，其结构经核磁、红外、质谱等确证，纯度经高效液相色谱鉴定，均达到99.5%以上，溶解度经高效液相色谱法测定为52.3-138.6 μm。

图2 白杨素含膦（磷）衍生物

2.2 白杨素含膦（磷）衍生物对Kasumi-1细胞增殖抑制活性筛选 为了筛选出增殖抑制活性较强的化合物，参照文献[5]报道先导化合物——白杨素抑制细胞活性的有效浓度，并以其作为阳性对照，12个化合物分别以100 μm作用细胞48 h，MTT试验检测细胞活性。结果见表1，衍生物3c、3e、3j、4b、7a、7b对Kasumi-1细胞有一定的增殖抑制活性。其中衍生物3c、7b对细胞的抑制活性远远高于先导化合物白杨素，比较差异有统计学意义（P<0.01）。

表1 白杨素膦（磷）酸衍生物对Kasumi-1细胞的增殖抑制率

以白杨素（chrysin）为对照，100 μm的3c、7a分别作用Kasumi-1细胞 0、12、24、36、48、60 h，结果见图 3。100 μm的3c作用36 h细胞活性最低，100 μm的7a作用48 h细胞活性最低。衍生物3c、7a对Kasumi-1细胞增殖抑制活性呈时间依赖性，且均强于白杨素，比较差异有统计学意义（P<0.01）。0、25、50、75、100 μm 的 3c、7a 分别作用Kasumi-1细胞48 h，结果见图4。衍生物3c在50 μm浓度时，细胞活性达到最低，衍生物7a在100 μm浓度时，细胞活性最低。衍生物3c、7a对Kasumi-1细胞增殖抑制活性呈浓度依赖性，且均强于白杨素，比较差异有统计学意义（P<0.01）。白杨素含膦（磷）衍生物3c、7a对Kasumi-1细胞增殖抑制的时效关系及量效关系见图3和图4。

图3 白杨素含膦（磷）衍生物3c、7a对Kasumi-1细胞增殖抑制的时效关系曲线

图4 白杨素含膦（磷）衍生物3c、7a对Kasumi-1细胞增殖抑制的量效关系曲线

2.3 白杨素含膦（磷）衍生物3c、7a对多个白血病细胞株的增殖抑制活性 为了探讨衍生物3c、7a对其他白血病细胞株的活性，选用衍生物3c、7a对Kasumi-1细胞株有效作用时间及浓度，分别作用于Jurkat细胞株、NB4细胞株、K562细胞株、HL60细胞株及U937细胞株，MTT法检测细胞活性。结果见图5、图6。衍生物3c、7a对以上细胞株的增殖均有明显的抑制作用，且呈时间及浓度依赖性。与对照组比较，作用时间48 h时，25 μm衍生物3c即对U937细胞产生明显的增殖抑制作用；50 μm浓度时对Jurkat细胞株、NB4细胞株、K562细胞株及HL60细胞株有明显的增殖抑制作用，差异具有统计学意义（P<0.01）。从时效关系方面看，与对照组比较，100 μm的3c作用24 h后，对U937细胞株及Jurkat细胞株有明显的增殖抑制作用；作用36 h后对NB4细胞株、K562细胞株及HL60细胞株有明显的增殖抑制作用，差异具有统计学意义（P<0.01）。不同浓度的衍生物7a作用各细胞株48 h，25 μm浓度时对HL60细胞及U937细胞即有明显增殖抑制效果，比较对照组，差异有统计学意义（P<0.01）；50 μm浓度时K562细胞及NB4细胞有显著增殖抑制效果，比较对照组，差异有统计学意义（P<0.01），而Jurkat细胞则在75 μm时出现明显增殖抑制作用。100 μm的7a作用各细胞株时效关系曲线显示，作用24 h，NB4细胞即出现一定的增殖抑制效果，比较对照组，差异有统计学意义（P<0.01）；作用36 h，除U937细胞外，其余细胞均出现显著增殖抑制作用，比较对照组，差异有统计学意义（P<0.01）；U937细胞出现一定程度增殖抑制作用，但与对照组比较，差异无统计学意义；U937细胞在48 h后出现显著增殖抑制作用，比较对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。

2.4 白杨素含膦（磷）衍生物3c、7a对AML患者BMMNCs的增殖抑制作用 10例初诊的急性白血病，其中M2a 4例，M5 1例，B-ALL 2例，T-ALL 2例，慢粒急变1例，分离骨髓单个核细胞，用不同浓度的白杨素含膦（磷）衍生物3c或7a处理48 h，取10例患者各浓度的OD值平均数做曲线，结果见图7。与细胞株结果类似，衍生物3c及7a对急性白血病患者的骨髓原代细胞均有明显的增殖抑制作用，且为浓度依赖性。

3 讨论

许多研究者对从植物中筛选出的天然黄酮类化合物（如葛根总黄酮、姜黄素、金莲花黄酮、染料木黄酮等）进行了广泛研究，发现其在体内外对多种白血病细胞均有一定的活性[6-7]，但是天然黄酮存在活性偏低、类药性差等缺点。为了提高其抗肿瘤活性，适应临床应用，各种各样的黄酮衍生物被合成[8-9]。文献报道最成熟的为国外研究者合成的Flavopiridol（夫拉平度，黄酮 L86-8275），Ⅰ期或Ⅱ期临床试验已证实此药单用或与其他化疗药物合用对难治复发性急性或慢性白血病均有肯定疗效[6，10]。

图5 白杨素含膦（磷）衍生物3c对各细胞株的增殖抑制活性

图6 白杨素含膦（磷）衍生物7a对各细胞株的增殖抑制活性

图7 白杨素含膦（磷）衍生物3c、7a对AML患者BMMNCs的增殖抑制作用

近年来许多国内外学者对白杨素衍生物的合成方法和生理活性进行了研究，对白杨素进行硝化、烷基化、羟甲基化、氟甲基化、膦（磷）酰化后合成的部分衍生物具有较强的抗肿瘤活性，在体外对许多肿瘤细胞都有明显的增殖抑制作用，如人胃癌SGC-7901 细胞、人肺癌A549 细胞、人肝癌HepG2细胞及HepB3细胞、人宫颈癌HeLa细胞、人鼻咽癌CNE-2细胞、人结肠癌（HT-29）细胞、人类小细胞肺癌NCI2H446细胞、人急性粒细胞性白血病HL-60细胞、人急性T淋巴细胞白血病Jurkat 细胞、急性白血病（M5）U937细胞等[5，11-13]。白杨素膦（磷）酰化结构修饰的报道较少，陈晓岚等[14]对白杨素进行了含膦（磷）改造，共合成出4种新的化合物，他们的研究结果表明，白杨素含膦（磷）衍生物与溶菌酶具有更强的亲和力。张婷等[15]合成了白杨素四乙基二膦（磷）酸酯，并发现白杨素和白杨素四乙基二膦（磷）酸酯对宫颈癌Hela细胞软琼脂的集落形成有明显抑制作用，能诱导并促进宫颈癌Hela细胞发生分化，且白杨素四乙基二膦（磷）酸酯在作用效果方面较白杨素明显，该研究提示膦（磷）酸基团的添加增强了抗肿瘤活性。

笔者通过化学法，将膦酸或膦（磷）酸基团引入到白杨素侧链中，新合成21个未见文献报道的白杨素含膦（磷）衍生物。这些白杨素含膦（磷）衍生物具备以下优点：（1）它们较白杨素具有更好的水溶性。预期在体内能较好的被吸收，可以弥补大多数天然黄酮因水溶性较差而导致生物利用率低的不足。（2）含膦（磷）基团是一些抗骨质疏松、抗病毒、抗肿瘤等药物分子的药效团，白杨素又具有广泛生物活性，所合成的白杨素含膦（磷）衍生物应用了药效团拼合原理，可能具有更好的药理活性。通过体外细胞增殖抑制试验，从新合成的白杨素含膦（磷）衍生物中筛选出对急性白血病（M2）细胞株Kasumi-1增殖抑制作用较强的2个衍生物（3c、7a），这两个化合物100 μm浓度作用48 h对白血病细胞的增殖抑制率分别为82.64%、79.23%，白杨素同等条件下对白血病细胞的抑制率为47.39%。此后，用衍生物3c及7a分别处理多个细胞株及急性白血病患者的骨髓原代细胞，发现，白杨素含膦（磷）衍生物3c及7a对检测的多个白血病细胞株及患者骨髓原代细胞均有明显的增值抑制作用，说明该两个衍生物有体外抗白血病活性，有进一步进行体内抗肿瘤活性研究的价值。

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