MMP-9、TIMP-1的表达与糖尿病合并肺结核发病的关系探讨*

陈健儿 吴文斌 郭健

糖尿病是临床常见的内分泌性疾病，而糖尿病患者患肺结核的几率是正常人群的3~4倍，两者之间互相影响，肺结核合并糖尿病患者常因营养代谢障碍、机体免疫力低下，易发生各种感染，使原已稳定的结核病灶重新活动。目前对糖尿病合并肺结核的研究多是关于血浆中各细胞因子的表达水平，而很大可能是细胞外基质的过度积累造成的，MMP-9是人体中药的基质金属蛋白酶，TIMP-1是其特异性抑制因子，两者的动态平衡对细胞外基质的含量有关键的作用，对糖尿病合并肺结核病的病因有较为密切的关系[1]。本研究探讨肺部病变基质金属蛋白酶-9（MMP-9）及组织金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）在不同程度的糖尿病合并肺结核病中的表达水平，旨在发现病因。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年12月-2014年12月在本院治疗的患者152例，其中A组60例为肺结核合并糖尿病患者，男28例，女32例，平均年龄（43.9±7.3）岁，肺结核确诊依据胸片及胸部CT或者痰菌培养阳性 ，糖尿病确诊依据空腹血糖、尿糖及糖耐量实验确诊；B组47例为肺结核非糖尿病患者，男23例，女24例，平均年龄（45.0±8.1）岁，肺结核合并糖尿病根据其病史、胸部X线检查、痰菌检查确诊；C组45例为对照组，无肺部病变，无其他器质性病变，男21例，女24例，平均年龄（46.0±7.8）岁。三组患者的年龄、性别比较差异无统计学意义（P>0.05）。经本院伦理委员会批准，纳入的所有患者均签署知情同意书后留取肺部组织。保留的肺组织10%甲醛溶液固定48 h，待免疫组化法测定。

1.2 诊断与排除标准 （1）诊断标准：肺结核诊断均由病理证实。2型糖尿病诊断标准按2010年ADA糖尿病诊断标准：①糖化血红蛋白A1c≥6.5%；或②血糖FPG≥7.0 mmol/L。空腹定义为至少8 h内无热量摄入；或③口服糖耐量试验时2 h血糖≥11.1 mmol/L；或④在伴有典型的高血糖或高血糖危象症状的患者，随机血糖≥11.1 mmol/L。而在无明确高血糖时，应通过重复检测来证实标准①~③。（2）排除标准：合并免疫系统相关疾病，心、肾功能衰竭，支气管结核，肿瘤；人免疫缺陷病毒阳性；近期应用免疫调节剂。

1.3 方法 采用免疫组化方法测定肾脏组织TIMP-1、MMP-9。选择TIMP-1、MMP-9兔抗人多克隆抗体作为检测抗体，MMP-9测定时组织无需处理，TIMP-1组织进行抗原热修复。新鲜配制的3% H2O2去离子水孵育10 min以灭活内源性过氧化物酶，PBS（0.01 mol/L，pH 7.25~7.35）冲洗2 min，3次。滴加MMP-9，37 ℃孵育1~2 h，PBS冲洗2 min，3 次。滴加兔IgG抗体-HRP多聚体，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗2 min，3次，选用DAB显色，蒸馏水充分冲洗，用中性树胶封固，空白对照采用PBS代替一抗[2-4]。结果判断：显微镜下观察各组中HE染色后的组织结构，观察免疫组化反应的定位、分布及染色强度，每张切片阳性细胞的着色为棕黄色和棕褐色，并且阳性细胞数>5%认为阳性表达。每例均设有HE切片作对照观察，并设阳性和阴性对照，用IPP 6.0（Image pro plus 6.0）分析图片，计算平均光密度（Average optical density，AOD）值。

1.4 统计学处理 使用SPSS 20.0进行分析，计量资料以（±s）表示，比较采用F检验，计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺结核活动性比较 A组的活动性肺结核患者27例（45.0%），非活动性结核患者33例（55.0%）；B组的活动性肺结核患者12例（25.5%），非活动性结核患者35例（74.5%）。A组活动性肺结核患者的比率较肺结核非糖尿病组高，说明肺结核合并糖尿病可能是肺结核活动性的影响因素。两组患者中活动性及非活动性患者比较，肺结核的活动度差异存在统计学意义（字2=4.312，P<0.05）。

2.2 三组患者MMP-9及TIMP-1蛋白表达比较 三组患者MMP-9及TIMP-1蛋白表达进行统计学比较，发现A组患者MMP-9及TIMP-1蛋白表达水平较B组和C组患者的高，B组患者的较C组患者高，且A组患者的MMP-9/TIMP-1的值较B组高，B组的较C组高。说明MMP-9和TIMP-1蛋白的表达在患者组较正常组高，而A、B组的比值中糖尿病患者组的MMP-9/TIMP-1更高，见表1。

表1 三组患者MMP-9及TIMP-1蛋白表达IOD值的结果分析

2.3 不同活动性肺结核患者MMP-9及TIMP-1蛋白表达的比较 活动性肺结核患者MMP-9及MMP-9/TIMP-1的蛋白的表达值比非活动性肺结核患者高，而活动性肺结核患者TIMP-1蛋白的表达却比非活动性肺结核患者的低，差异均有统计学意义（P>0.05），见表2。

表2 不同活动性肺结核患者MMP-9及TIMP-1蛋白表达IOD值的比较

3 讨论

近年来ECM重塑在肺纤维化形成中的作用已成为当今的研究热点，而ECM重塑的有两种重要的细胞外基质表达MMPS和TIMPs[5-6]。MMPs是一组锌、钙离子依赖性的蛋白水解酶家族，主要功能是在正常的重塑和修复过程中降解基底膜和间质胶原等细胞外基质成分，其活性主要受其特异性抑制剂TIMPs的调节[7]。组织金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）是MMP-9的特异性抑制剂，它以共价键的形式与MMP-9相结合成复合体，特异性抑制MMP-9活性是重要的蛋白质降解调控因子。MMPs及TIMPs所调节的细胞外基质降解减少可能是肺纤维化发生的重要因素，MMP-9能够降解分布于基底膜和肺间质的Ⅳ型胶原，TIMP-1是MMP-9的特异性抑制剂，由于胶原沉积在肺纤维化过程中起着关键的作用，胶原酶具有切割纤维胶原蛋白的天然螺旋结构能力的下调，可能对疾病的进展也可以发挥显著作用[8-10]。根据此观察，TIMPs的过度表达导致MMPs和它的抑制因子之间失衡，从而引起不利于胶原活性的微环[11-12]。TIMP-1主要来自于肺泡巨噬细胞及上皮细胞，TIMP-2和TIMP-3的基因表达成组成型，TIMP-1在纤维化过程表达上调，TIMP-1的表达与疾病的进展阶段相关联，并且可能会阻止MMP导致的细胞外基质的降解，并且作为结果可能参与了细胞外基质的沉积，MMP-9的检测被建议可作为肺纤维化的预后因素。

糖尿病为临床常见的内分泌代谢疾病，由于糖尿病的存在使肺结核恶化或难以治愈，肺结核的存在又可使糖尿病不易控制，两者之间互为因果，造成恶性循环。而肺结核合并糖尿病的病因机制尚不完全清楚，近年来研究发现EMC的酶降解系统异常可能对糖尿病合并肺结核发病有一定的作用。而MMP-9的表达会抑制TIMP-1，MMPs的合成、分泌及激活过程的各个环节都受到严密监控，一些细胞因子、生长因子及激素等能调节MMPs合成[13-14]。

本研究发现，在本院入院的糖尿病合并肺结核的患者中活动性肺结核患者的比例显著高于非糖尿病肺结核的患者，说明糖尿病对肺结核的活动性在一定程度上有影响，这可能与糖尿病会造成体内高糖的环境，改变正常的代谢有关[15]。糖尿病的发生影响了EMC酶降解系统的异常表达，增加了肺结核的活动性。在分别检测了肺结核合并糖尿病组、肺结核非糖尿病组、正常肺部组的MMP-9、TIMP-1及MMPs三组指标的比值，发现肺结核合并糖尿病组比值都较其他两组显著较高，且肺结核非糖尿病组的三项指标也较正常组的高，这也直接说明糖尿病对肺结核的发生有促进作用，MMP-9、TIMP-1及抗蛋白酶系统对糖尿病患者肺部纤维组织的形成有较大的影响，且MMP-9、TIMP-1及其比值与疾病的发生有着较为密切的关系。MMP-9及TIMP-1比率失衡是细胞外基质重塑和气道阻塞的关键，MMPs和其抑制因子的在其他呼吸道纤维化疾病时有研究，提示他们可能是气道炎症及气道重塑有用的生物学标志。在笔者的研究中，灌洗液中细胞基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达显著升高，MMP-9/TIMP-1比率明显失衡，笔者的结果提示基质金属蛋白酶-9（MMP-9）可能参与糖尿病合并肺结核的致病过程，对肺结核患者的预测及诊治可能有一定的参考价值。随后，笔者又将活动性肺结核患者和非活动性肺结核患者的三项指标进行对比，免疫组化的结果显示活动性肺结核患者的MMP-9、MMP-9/TIMP-1值较非活动性的高，但TIMP-1蛋白的表达值却较非活动性肺结核患者的低，差异均存在统计学意义（P<0.05）。这再次说明MMP-9、TIMP-1的值与肺结核的病变程度密切相关，活动性肺结核患者的肺部纤维化更为严重，多项证据证实MMPs/TIMPs功能紊乱，尤其是TIMP-1的增多，MMP的活性会受到限制，可促进肺间质纤维化形成。MMP-9/TIMP-1比率失衡可能是导致糖尿病合并肺结核患者发生肺部纤维化的重要因素。

本研究提示TIMP-1、MMP-9与糖尿病合并肺结核病变程度密切相关，尤其是对肺部纤维化有着重要影响，可作为鉴别糖尿病是否已合并肺结核的指标。MMP-9/TIMP-1比值的失衡在肺结核合并糖尿病的发病过程中发挥着重要作用。此研究为糖尿病合并肺结核的病因学机制提供实验支持，并为深入探索糖尿病合并肺结核机制提供一定的理论依据。

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