金粟兰在肿瘤内科治疗中的作用机制研究

陈 梁，杨志宏

(内蒙古乌海市人民医院 肿瘤科，内蒙古 乌海 016000)



金粟兰在肿瘤内科治疗中的作用机制研究

陈 梁，杨志宏

(内蒙古乌海市人民医院 肿瘤科，内蒙古 乌海 016000)

目的：探讨金粟兰倍半萜内酯类化合物LSE-3在肿瘤内科治疗中的作用机制。方法：利用蛋白印记法检测表皮生长因子(EGF,25ng/mL)诱导人乳腺癌细胞上皮间质转化(EMT)前后及不同LSE-3作用EMT细胞48h后，间质标记物Snail、Slug以及LSE-3可能作用的其它靶点如p53等相关信号分子蛋白表达情况。结果：蛋白印记对Snail、Slug、p53蛋白表达量检测结果显示，与EGF诱导组相比，人乳腺癌细胞中Snail、Slug蛋白表达显著下调(P<0.05)，p53蛋白表达显著上调(P<0.05)，且都与LSE-3呈剂量依赖关系。结论：LSE-3能逆转EGF诱导的人乳腺癌细胞(MDA-MB-231、MDA-MB-468)上皮间质转化的产生,降低发生了EMT的人乳腺癌细胞(MDA-MB-231、MDA-MB-468)的侵袭转移能力。

金粟兰、LSE-3、乳腺癌细胞、作用机制

金粟兰又名珠兰、鱼子兰、茶兰等，原产我国南部，喜温暖、潮湿和通风的环境，多生于山坡、沟谷密林下。半灌木，直立或稍平卧，高30～60cm。金粟兰生性强健，容易栽培，用分株、扦插和压条繁殖皆可。全株入药，有活血驱虫、祛风湿、接筋骨之效。但目前最新研究发现金粟兰倍半萜内酯类化合物LSE-3在抑制肿瘤方面有很好的疗效，故本文采用两株人乳腺癌细胞作为研究对象，探讨LSE-3在肿瘤内科治疗中的作用机制。

1 实验材料与仪器

1.1 主要实验仪器

细胞培养箱(日本SANYO公司，MCO-750C02)、倒置荧光显微镜(Leica公司)、三蒸水发生器(上海亚荣生化仪器厂)、液氮生物容器(四川亚西生物容器有限公司，YDS-35-125)、医用超净工作台(苏州冯氏实验动物设备有限公司)、台式高速冷冻离心机(Thermo公司)、Western blotting电泳仪、Western Blot电转仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 主要实验材料与试剂

从本实验室当年收获的宽叶金粟兰、多穗金粟、丝穗金粟兰和植物肿节风这四种金粟兰科植物中提取得到LSE-3。MDA-MB-231细胞、MDA-MB-468细胞(人乳腺癌细胞株购于协和细胞库中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心)，使用Leibovitz's L-15培养基(Gibco,41300-039)；重组人表皮生长因子EGF( 购于美国PeproTech公司，产品批号：0212AFC05)；M-PER即Mammalian Protein Extraction Reagent(蛋白提取试剂, Thermo公司：78503)，鼠抗人β-actin单克隆内参一抗(anbo生物技术公司)、HRP标记山羊抗兔二抗(北京全式金生物技术有限公司)、HRP标记山羊抗鼠二抗(北京全式金生物技术有限公司)；鼠抗人p53单克隆一抗、兔抗人Snail单克隆一抗、兔抗人Slug单克隆一抗(美国Cell Signaling公司)。

2 试验方法

2.1 实验分组

设置含25ng/mL的LSE-3药组(0.5μg/mL,1μg/mL, 3μg/mL,10μg/mL)；25ng/mL EGF组与空白组(无EGF)，收集对数期细胞若干瓶，制成细胞悬液，调整细胞悬液密度为6×106个/mL；将上述细胞悬液分别加入六个直径为10cm的无菌培养皿中，分组培养。

2.2 蛋白样品制备

按照提取蛋白试剂盒的方法提取细胞内蛋白。

2.3 检测Snail、Slug、p53蛋白表达

使用Western Blot方法检测各蛋白的表达量。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 Snail、Slug在各肿瘤细胞株内的表达

Western Blot结果显示(见图1)，随LSE-3给药浓度的增加，Sanil、Slug在两株细胞内的表达均下调，与给药浓度呈现一定的依赖关系；以β-actin蛋白为内参，如图2显示，给药组的Snail、Slug的相对表达量与模型组(EGF组)的相对表达量比较差异显著,具有统计学意义(P<0.05)。

图1 Snail、Slug蛋白在各乳腺癌细胞中的相对表达量

图2 I：Snail的相对表达量；II：Slug的相对表达量

3.2 p53在各细胞中的表达

陈雁[1]在研究中发现，p53参与了皮肤肿瘤发生EMT进程，并认为p53是一个调控EMT的重要“关卡”。实验结果显示(见图3)，LSE-3对MDA-MB-231、MDA-MB468这两株肿瘤细胞作用48h后，细胞内p53的表达均随着LSE-3浓度的增加而上调；如图4所显示，以β-actin蛋白表达量为内参，各给药组与模型组(EGF组)相比，其p53的表达量具有显著性差异(P<0.05)。

4 讨论

金粟兰多具有抗菌消炎，散弃活血的功效，通常用于治疗跌打损伤、瘀血肿痛、骨折、风湿性关节炎等[2]，在民间是治疗肿疖，毒蛇咬伤和跌打损伤的良药。该属植物的一些化学成分具有良好的细胞毒作用和抗菌活性[3]。现代药理实验表明金粟兰属植物多具有抗菌、抗肿瘤、增强免疫、抗病毒、抗溃疡、镇痛、抗血小板聚集、收缩子宫等活性[4]。金粟兰属作为我国分布较全并且特有存在的种属，目前其研究与开发尚不深入，仍有很多问题有待研究探讨，如该属与其近缘属草珊瑚属在化学成分和药理作用方面的异同，由金粟兰科草珊瑚属植物草珊瑚中分离得到的抗菌抗肿瘤的有效成分等。本文通过人的乳腺癌细胞研究了金粟兰内倍半萜内酯类化合物LSE-3在肿瘤内科治疗中的作用机制。

图3 p53蛋白在各乳腺癌细胞中的相对表达量

图4 p53蛋白在各乳腺癌细胞中的相对表达量

Snail、Slug均属于Snail家族成员，是均含有锌指结构的DNA结合蛋白，也是间质细胞标志分子。大多研究显示，虽然诱导肿瘤细胞发生EMT化的因素各不相同，这些诱因包括生长因子、细胞外基质、蛋白酶及缺氧等，但是其发生EMT的过程是相似的，而Snail转录因子便是在调节上皮间质转化过程中各种信号转导的共同下游靶基因，目前所已知的EMT的过程中几乎都与Snail的激活有关。Snail与Slug在肿瘤细胞EMT过程中扮演了至关重要的角色，被当作分子靶向逆转EMT的重要性不容忽视，而本实验结果证实，LSE-3能够明显抑制其在人乳腺癌肿瘤细胞(MDA-MB-231、MDA-MB-468)中的表达。

p53是调控细胞周期的重要蛋白，尤其是在细胞受到损伤后，能通过调控与细胞周期、凋亡相关的基因，使细胞周期发生阻滞，直到细胞修复损伤为止。目前关于其研究集中在对细胞周期、细胞凋亡和基因稳定性等方面的作用[5]。肿瘤界对p53与EMT之间关系的研究才刚刚起步，两者之间的调控机制及关系还不确切，因此可能是今后寻找逆转肿瘤EMT化作用的一个全新的靶点，也需要更多的研究与理论来阐述此问题。

LSE-3抗人乳腺癌EMT的机制是多途径、多靶点综合作用的结果，并且始终贯穿肿瘤的发生、发展以及侵袭与转移等多个过程。但是这种逆转作用是以蛋白水平为主，还是以转录水平为主要作用，或者是在EMT发展的过程中对不同发展阶段有着不同的调控机制并不清楚，需要采用更丰富的实验手段和更为严密的实验设计进一步研究和证实，这也是本课题下一步研究的重点与方向。深入了解与研究其介导的机制，可为将LSE-3作为抑制肿瘤药物的开发提供更多的证据，同时也为开发更多相关药物提供有价值的参考。

[1] CHAMBERS AF, GROOM AC, MACDONALD IC. Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sitesr[J]. Nature Reviews Cance，2002(2):563-572.

[2] 李时珍.本草纲目[M].北京:人民卫生出版社，1982;820.

[3] 吴征锐，周太炎，肖培根.新华本草纲要[M].上海:上海科学技术出版社，1991：64.

[4] KAWABATA J，FUKUEHI Y, TEHARA S, et al. Strictures quiterpene alcohols from Chloranthus japonicas of novel ees-Agric [J].Biol Chem，1984,48(3)：713.

[5] ZHIVOTOVSKY B, KROEMER G. Apoptosis and genomic instability[J]. Nat Rev Mol Cell Biol,2004,5(9):752-762.

(责任编辑：魏 晓)

2014-09-02

陈梁(1972-)，男，内蒙古乌海市人民医院主治医师，研究方向为肿瘤内科放化疗。

R246.5

A

1673-2197(2015)01-0009-02

10.11954/ytctyy.201501005