四棱豆肽的分离鉴定及其抗疲劳特性研究

刘晶　王海燕　刘焕云　许冬倩　王子萧

摘 要 为了探讨四棱豆肽组分的抗疲劳效果及对抗疲劳肽进行分离和鉴定，采用碱性蛋白酶对四棱豆蛋白进行酶解，经反相液相色谱分离后，得到Sample1、Sample2和Sample3 3个主要组分，分别以1.5 g/kg体重的剂量灌胃小鼠。结果表明：经游泳耐力实验，3个组分都可以延缓小鼠的游泳疲劳，但与四棱豆蛋白组相比，仅Sample3肽成分可以显著延缓小鼠的游泳疲劳，提高血浆中葡萄糖和游离脂肪酸的含量和肝糖原的水平。通过氨基酸组成分析，Sample3中富含抗氧化的疏水氨基酸（Leu、Ala、Ile、Pro、Val和Phe），可以有效延缓由自由基引发的疲劳。经过色谱分离，得到Sample3肽成分中一个优势的小肽S1，其氨基酸序列为Gln-Ser-Pro-Pro-Glu-Ile-Asn-Thr-Val，符合抗疲劳肽的特点。灌胃小鼠sample3组分和分子量小于1 000的米渣蛋白肽，疲劳前的游泳时间没有显著性差异，灌胃肽S1后的小鼠疲劳前的游泳时间显著增加。说明肽S1是一种潜在的天然抗疲劳物质。

关键词 抗疲劳；四棱豆蛋白；四棱豆肽；分离鉴定

中图分类号 Q493.2 文献标识码 A

Isolation and Characterization of a Peptide from Psophocarpus tetragonolobus（L.）DC. with High Anti-fatigue Activity

LIU Jing1，WANG Haiyan1，LIU Huanyun1，XU Dongqian1，WANG Zixiao2

1 College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Economics and Business，Shijiazhuang，Hebei 050061，China

2 College of Bioscience and Bioengineering，South West University of Science and Technology，Mianyang，Sichuan 621010，China

Abstract In order to explore the effect of a peptide with high anti-fatigue from Psophocarpus tetragonolobus（L.）DC.，the peptide was separates and characterized after alkalase hydrolysis. Three main components， Sample1，Sample2 and Sample3 were separated by RP-HPLC. The swimming fatigue time could extend significantly compared with that in vehicle group in swimming endurance test for the mice orally administered three components a dose of 1.5 g/kg body weight respectively. Compared with the P. tetragonolobus protein group，only the Sample3 group could significantly prolong the swimming fatigue time，and increase the content of glucose and free fatty acids in plasma and the level of hepatic glycogen. By amino acid composition analysis，Sample3 contained abundant antioxidant amino acids，such as Leu， Ala， Ile， Pro， Val and Phe（hydrophobic amino acid），and could effectively delay the fatigue induced by free radicals. After chromatographic separation，a small peptides S1 with mino acid sequence Gln-Ser-Pro-Pro-Glu-Ile-Asn-Thr-Val was identified from Sample3，which was in line with the characteristics of anti-fatigue peptide. There were no significant differences in swimming fatigue time in Sample3 group and rice residue peptide group with molecular weight of less than 1 000. The swimming fatigue time of mice in peptide S1 group increased significantly. Peptide S1 could be used as a natural anti-fatigue substance.

Key words Anti-fatigue；Four winged bean protein；Four winged bean peptide；Isolation and identification

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.12.018

四棱豆种子的蛋白质含量为30%，含多种氨基酸，种类高达18种，包括各类人体必需氨基酸，其中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸的含量丰富，且氨基酸组成合理，其中赖氨酸含量比大豆还高[1-2]。四棱豆中富含的VE、硒元素和豆类黄酮物质是抗氧化和缓解脂质过氧化的重要组成部分。四棱豆具有一定的药用价值，具有防衰老、抗癌、降压、补血、明目及清热解毒等多项功效[3]。目前国内对四棱豆的研究主要有吉首大学研制的四棱豆乳酸发酵饮料[4]；广东肇庆学院在四棱豆叶中提取凝集素并对凝集活性进行研究[5]，湖南农业大学用四棱豆硒蛋白灌胃大鼠，增加大鼠体内的硒含量。四棱豆同其他豆科植物一样均含有若干抗营养因子，其中活性较强的蛋白酶抑制剂与血球凝集素制约了四棱豆的应用。在国外，Wan等[6]制备出具有高血管紧张素转换酶抑制活性的四棱豆肽，Alexander等[7]从四棱豆中提取凝集素。

四棱豆蛋白经碱性蛋白酶水解，可得到四棱豆肽[8]，消除了抑制剂和凝集素的不良作用。与蛋白相比，低分子的肽更易被人体吸收和利用[9-10]，一些植物动物蛋白肽已经应用于运动食品及抗疲劳保健食品[11]。目前，还未见关于四棱豆蛋白肽具有抗疲劳特性的文献报道。研究四棱豆肽抗疲劳性等生物活性，为更好地开发、利用热带作物资源及提高四棱豆蛋白的利用提供了理论依据；分析抗疲劳肽的结构特点为研究肽的抗疲劳机理奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与试剂 四棱豆购自济南绿禾野菜种业有限公司；所有抗疲劳试验试剂盒购自南京建成生物工程中心；碱性蛋白酶购自诺维信；色谱分析试剂为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备 实验所用主要设备见表1。

1.2 方法

1.2.1 四棱豆肽和四棱豆蛋白制备工艺 四棱豆肽：四棱豆蛋白→配成溶液→调pH值→酶解（碱性蛋白酶）→灭酶（95 ℃，15 min）→离心（4 000 r/min，20 min）→上清液→四棱豆肽→反相高效液相色谱分离→得到Sample1、Sample2和Sample3 3个优势组分→冷冻干燥

四棱豆蛋白制备工艺：四棱豆→脱皮→粉碎→60 ℃乙醚回流脱脂6～8 h→调至pH10→离心（4 000 r/min，20 min）→上清液→调至pH4→离心（4 000 r/min， 20 min）→取沉淀→四棱豆粗蛋白→大孔树脂的分离纯化[12]→冷冻干燥→四棱豆蛋白[13]

1.2.2 样品和小鼠处理 60只小鼠被分为6组（每组n=10），每组实验鼠分别给予1.5 g/kg体重的灌胃剂量，各处理如下：（1）对照组（0.9%生理盐水）；（2）四棱豆蛋白组（FWBP）；（3）四棱豆肽组（FWBPP）；（4）Sample1组；（5）Sample2组；（6）Sample3组。上述所有样品都溶解在0.9%的生理盐水中，给实验鼠的灌胃剂量为每天200 μL，持续6周。

1.2.3 抗疲劳试验 采用游泳耐力实验，利用不同含量的葡萄糖、乳酸、游离脂肪酸（NEFA）和血液中尿氮（BUN）、肝糖原和肌糖原进行四棱豆蛋白及其肽的抗疲劳实验[12]。

1.2.4 氨基酸分析 准确吸取0.2 mL 混合氨基酸标准样液，用pH2.2的缓冲液稀释至氨基酸浓度为5 nmol/50 μL。分别往氨基酸自动分析仪中注入氨基酸标准液和待测样品，测定样品中的氨基酸含量。

样品的氨基酸组成/（g/kg）=

×1 000

1.2.5 四棱豆肽的分子筛色谱和反相高效液相色谱纯化以及肽的氮端测序 经分子筛色谱纯化后的峰样品，经反相高效液相色谱进一步纯化得到肽样品，再经肽的氮端测序得到纯化肽的氨基酸序列[12]。

1.2.6 肽S1与sample3和分子量小于1 000的米渣肽（RSPⅠ）抗疲劳特性的比较 通过游泳耐力实验对纯化出的肽S1与sample3和分子量小于1 000的米渣肽[12]进行比较，对肽S1的抗疲劳特性进行评价。

2 结果与分析

2.1 四棱豆肽的RP-HPLC分离

由图1可以看出，四棱豆蛋白经过酶解后的水解蛋白组成复杂。取反相色谱分离后的3个优势组分Sample1、Sample2和Sample3作为下一阶段抗疲劳作用的试验物质。随着保留时间的延长，3个组分的疏水性依次提高。

2.2 四棱豆蛋白和四棱豆肽的成分分析

从表2可以看出，四棱豆蛋白和四棱豆肽的组成没有显著性差异，但通过反相液相色谱分离出的3个肽组分Sample1、Sample2和Sample3中的蛋白质含量高于四棱豆蛋白和四棱豆肽的。为了避免不同组之间由于蛋白含量的差异而造成灌胃小鼠抗疲劳能力的差异，实验需要灌胃相同蛋白含量的样品。各组间脂肪和水分含量没有显著差异；虽然Sample1、Sample2和Sample3的灰分含量显著低于四棱豆蛋白和四棱豆肽的，但灰分不具有抗疲劳特性，因此其它成分不会对各组的抗疲劳特性产生影响[7]。

2.3 小鼠疲劳前的游泳时间比较

由表3可以看出，在第一周和第二周时，疲劳前不同组之间的游泳时间没有显著性差异；在第四周和第六周时，四棱豆肽和其3个组分组疲劳前的游泳时间与对照组之间具有显著性差异，且Sample3游泳时间明显长于FWBP组；在第六周时，Sample1、Sample2和Sample3组与对照组都具有显著性差异，但仅Sample3组与FWBP组和FWBPP组相比游泳时间显著延长。六周内，对照组和FWBP组游泳时间没有显著性差异；在第四周和第六周时，FWBPP、sample1和sample2组与FWBP组相比无显著性差异。

2.4 四棱豆肽的抗疲劳作用

在6组小鼠中，Sample3组中血浆葡萄糖值最高，与其它组有显著性差异。FWBP、FWBPP、 Sample1和Sample2组与对照组相比也能显著提高血浆中葡萄糖的含量（表4），但与FWBP组相比，仅Sample3组可以显著提高血浆中的葡萄糖值。除Sample3组外，各组之间血乳酸含量没有显著性差异。Sample2组和Sample3组显著提高了NEFA的浓度。各组中BUN含量无显著性差异。与对照组相比，Sample1、Sample2和Sample3组中肝糖原的含量显著提高，但仅Sample3组中肝糖原的含量显著高于FWBP组。各组之间肌糖元的含量没有显著性差异。

2.5 四棱豆肽及其组分的氨基酸分析

由表5可以看出，Sample3中Leu、Ala、Ile、Pro、Val和Phe等疏水性氨基酸的含量远远高于FWBP组和Sample1、Sample2组。Ren等[14]研究发现，当肽中含有疏水性氨基酸时，肽链表现出较高的抗氧化活性，能够抑制氧自由基、金属离子等催化的脂类氧化，因而具有广泛的细胞保护和抗疲劳作用，这是Sample3具有较高的抗疲劳性的原因之一。

2.6 Sample3组分的分子筛色谱和RP-HPLC纯化

如图2-A所示，通过分子筛高效液相色谱对Sample3进行提纯，得到一个优势组分P1。将P1进行RP-HPLC纯化，结果如图2-B所示。分子筛高效液相色谱是通过分子的大小和形状的不同分离肽物质的，因此得到的峰物质P1是分子大小和形状相近的肽，为了保证P1的纯度，需要对P1进一步纯化。RP-HPLC是根据分子疏水性的差异进行肽的分离。2种色谱的分离原理不同，具有相近分子量及形状的肽疏水性可能差异很大，因此通过2种方式的色谱分离可以使分离后的肽纯度提高[12]。将S1通过RP-HPLC分离纯化后，得到一个纯化的肽S1。

2.7 组分S1的氮端测序结果

通过蛋白测序仪测定组分S1的氨基酸组成，结果见图3，S1肽段共有9个氨基酸，组成为Gln-Ser-Pro-Pro- Glu-Ile-Asn-Thr-Val。

2.8 四棱豆肽和米渣肽耐疲劳游泳实验的比较研究

已有研究证明，分子量小于1 000的米渣肽具有较高的抗疲劳特性[12]。由表6可以看出，四棱豆肽的组分Sample3和分子量小于1 000的米渣肽相比，疲劳前的游泳时间没有显著差异。说明具有高疏水性的四棱豆肽的抗疲劳性与分子量小于1 000的米渣肽相当。Sample1、Sample2和Sample3 3个组分的分子量均低于1 000，但仅抗疲劳性高的Sample3与米渣肽没有显著性差异，说明四棱豆肽的抗疲劳性低于米渣肽，这在一定程度上限制了四棱豆肽的应用。但灌胃从四棱豆中纯化出来的肽S1，4周后小鼠疲劳前的游泳时间显著增加，说明肽S1可以作为一种潜在的天然抗疲劳物质，在四棱豆肽中是否存在其它高抗疲劳肽还需要进一步研究。

3 讨论与结论

选取经RP-HPLC分离后含量最高的3个肽成分，通过游泳耐力试验发现，与对照组相比3个肽成分都可以延缓小鼠的游泳疲劳。但与四棱豆蛋白组相比，仅Sample3肽成分可以显著延缓小鼠的游泳疲劳。疲劳前的游泳时间是评价灌胃物质抗疲劳效果的直观指标，灌胃小鼠四棱豆蛋白和四棱豆肽后，游泳时间延长，Sample3抗疲劳效果优于其它组。Yu等[15]发现灌胃小鼠高剂量的大豆肽，可以使疲劳前的平均游泳时间增加70%。本研究中，灌胃Sample3后，在第六周时小鼠疲劳前的游泳时间比四棱豆蛋白组增加139%。在四棱豆肽3组组分中，sample3富含Leu、Ala、Ile、Pro、Val和Phe等疏水性氨基酸和支链氨基酸，可以捕获自由基，能对抗运动所致的自由基损伤，清除或阻断自由基的链式反应，延缓在运动中产生的自由基引发的疲劳[16]。Ding等[17]发现具有较高自由基清除活性的水母胶原蛋白水解物可以显著延缓小鼠的运动疲劳。You等[18]发现用木瓜蛋白酶水解的具较高抗疲劳特性的泥鳅蛋白肽中支链氨基酸含量高，这与本研究结论[Sample3中支链氨基酸（亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸）的含量高，具有高抗疲劳特性]一致。

灌胃小鼠Sample3后，小鼠血浆中葡萄糖、NEFA、肝糖原含量显著提高，血乳酸含量显著降低。高葡萄糖含量可以保证小鼠在运动过程中的能量供应，减少由于能量不足而引发的肌肉疲劳。血乳酸含量的显著降低可以避免由于肌肉酸痛而造成的疲劳感。NEFA含量的增加，表明脂肪代谢增加，脂肪部分代替葡萄糖成为了能量的利用物质[19]。Li等[20]灌胃小鼠中、高剂量的黑豆肽显著降低了小鼠血乳酸的含量。Sampe3组小鼠肝糖原含量较四棱豆蛋白组高55%以上，有利于小鼠在运动中的能量补给，提高小鼠的游泳耐力。与蛋白组相比，Wang等[21]制备的鲐鱼肽可以提高33%～35%的肝糖原水平，低于四棱豆肽对肝糖原的补充水平。BUN 含量可反映体内蛋白质分解情况，当能量供应不足时，可导致肌肉蛋白质分解以供能，蛋白质作为身体的框架结构成分，如果被分解破坏必然会导致生物学功能的正常发挥受到影响，出现疲劳等症状。由于小鼠灌胃的物质是肽，其在肌肉组织中氧化脱氨，一方面生成相应的 α- 酮酸进入三羧酸循环氧化以供能；另一方面，脱下来的氨基与丙酮酸或谷氨酸偶联，形成丙氨酸和谷氨酸酰胺，以提供能量，在特殊的应急情况下，可直接向肌肉供能。由于肽易于被吸收及迅速利用，因此抑制或缩短了体内“负N平衡”，尤其是运动前添加肽，可减少肌蛋白降解，维持体内正常蛋白质合成，减轻或延缓由运动引发的其它生理方面改变，达到抗疲劳的效果[22]。

经过RP-HPLC和分子筛液相色谱分离得到Sample3肽成分中的一个优势小肽S1，经蛋白质测序仪测定，肽的氨基酸序列为Gln-Ser-Pro-Pro-Glu-Ile-Asn- Thr-Val。肽S1中富含Pro这一抗氧化性氨基酸，碳端具有Val，内部具有Ile，这些氨基酸具有较高的抗氧化活性，可以延缓由自由基引发的疲劳。肽S1符合抗疲劳肽的特点，可以作为一种潜在的天然抗疲劳物质。目前，仅有Wan等[6]从四棱豆中制备出了具有高血管紧张素转换酶抑制活性的肽，而对四棱豆抗疲劳肽的制备和鉴定还未见相关报道，因此，对四棱豆肽生物活性的研究及其机理探讨有待深入。

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