木糖筛选系统对杜鹃红山茶愈伤组织诱导及生长的影响

王江英　吴斌　范正琪　李纪元

摘 要 在农杆菌介导的遗传转化过程中，抗生素不同程度地抑制山茶转化体的生长与分化。以木糖异构酶基因xylA为筛选标记，试图建立杜鹃红山茶（Camellia azalea）遗传体系过程中的非抗生素筛选系统。从大肠杆菌Top10中扩增出xylA基因，并用其替换经改造的植物表达载体pCAMBIA1300中的hptⅡ基因，获得植物表达载体pCAMBIA1300-xylA并导入根癌农杆菌EHA105中，经农杆菌介导转化烟草结果表明，xylA标记基因可以替代卡那霉素应用于烟草转化体中，且效果更优。以杜鹃红山茶带柄叶片、茎段、子叶为外植体诱导的愈伤组织，生长状态均表现良好，愈伤组织启动诱导的所需天数比对照组提前约10 d，生长量为对照组的1.5～2.5倍。可以认为25 g/L的木糖浓度是适合杜鹃红山茶愈伤组织诱导及生长的筛选浓度。

关键词 杜鹃红山茶；愈伤组织；诱导；生长；木糖筛选

中图分类号 S685.14 文献标识码 A

杜鹃红山茶（Camellia azalea）自然分布于广东省阳春市鹅凰嶂自然保护区，四季着花，夏季盛花，花色艳丽，是中国特有的山茶遗传种质，也是培育四季茶花新品种的特异亲本。杜鹃红山茶的杂交育种已取得突破性进展[1-2]。通过分子生物学技术将不同功能的外源基因导入杜鹃红山茶中，以加速培育抗逆性强的杜鹃红山茶特异新品种势将成为新的发展趋势之一。然而，山茶属植物离体再生困难，转化效率低，最终转基因成功的报导极少，仅山茶属的茶树（Camellia sinensis）通过农杆菌介导法和卡那霉素（Kanamycin）筛选体系成功获得转基因植株[3]。范正琪等[4]发现卡那霉素、潮霉素（Hygromycin）对山茶愈伤组织诱导及生长有较大的影响，抗生素浓度较高时，愈伤组织容易褐变，分化状态不佳，因此未能获得再生植物。转基因桃及杨树的实验中也发现较高浓度的卡那霉素会抑制转基因植株的再生甚至完全抑制芽的分化[5-6]。

1996年Joersbo等[7]发现糖基因参与的正向选择系统可以解决植物组织对抗生素敏感的问题，其中木糖异构酶基因（xylose isomerase，xylA）通过编码的木糖异构酶，将木糖转变为植物可利用的木酮糖，从而达到筛选细胞的作用[8-10]。目前木糖筛选系统已在玉米、花生及黄瓜等植物中获得成功[11-13]，然而将此系统应用于山茶方面的研究尚未见报道。

笔者以杜鹃红山茶带柄叶片、茎段、子叶为外植体，以木糖为筛选系统，研究其对杜鹃红山茶不同外植体愈伤组织诱导及植株再生的影响，为优化杜鹃红山茶高效稳定的遗传转化体系提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以烟草及杜鹃红山茶带柄叶片、茎段及子叶为组培材料。农杆菌EHA105、pCAMBIA1300载体为本实验保存，大肠杆菌Top10感受态细胞购自北京全式金生物有限公司，大肠杆菌DH5α购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大肠杆菌xylA基因的扩增 大肠杆菌Top10基因组DNA提取参照试剂盒说明书进行。根据GenBank中登录的xylA基因序列（GenBank登录号：X04691）设计引物，上下游引物5' 端添加XhoⅠ酶切位点。F1：5′-CCGCTCGAGATGCAAGCCTATTT

TGACC-3′；R1：5′-CCGCTCGAGTTATTTGTCGAA

CAGATAA-3′。以大肠杆菌Top10基因组DNA为模板，高保真酶扩增xylA基因全长。

1.2.2 植物表达载体pCAMBIA1300-xylA构建

用XhoⅠ酶分别酶切pCAMBIA1300和pGEM-T-xylA，回收pCAMBIA1300载体大片段和pGEM-T-xylA的小片段，T4 DNA连接酶16 ℃过夜连接大小片段。XhoⅠ酶切检验xylA是否插入，PCR检测插入片段的方向。检测引物为CaMV35S promoter末尾端的一段序列及CaMV35S polyA初始端的一段序列，分别为F2：5′-GATGTGATATCTCCACTG

ACG-3′；R2：5′-AGCTTGTCGATCGACAGATC-3′。

1.2.3 xylA基因在模式植物中的功能鉴定 将pCAMBIA1300-xylA转化到根癌农杆菌EHA105中，利用改良的Horsch“叶盘法”转化烟草[14]，外植体为生长旺盛的烟草无菌苗叶片，将其剪成1 cm×1 cm的叶盘，无需预培养，直接进行农杆菌侵染15 min，无菌水冲洗5次，共培养2 d后，转至诱导培养基中进行愈伤组织诱导。其中共培养基组分为：MS（30 g/L蔗糖）+2.25 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+6.5 g/L植物琼脂，愈伤组织诱导及分化培养基为：MS（15 g/L蔗糖+15 g/L木糖）+2.25 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+6.5 g/L植物琼脂+200 mg/L Tim （特美汀，Timentin），不定芽生根培养基为：1/2 MS（15 g/L蔗糖+15 g/L木糖）+6.5 g/L植物琼脂+200 mg/L Tim[11-13，15]。对照组为空载体pCAMBIA1300转EHA105，共培养基同实验组，愈伤组织诱导、分化培养基及不定芽生根培养基中碳源为30 g/L蔗糖，另外添加50 mg/L Kan，其余组分同实验组。每组50个叶盘，重复3次。

观察烟草遗传转化过程中木糖对转化体的影响，统计愈伤诱导率、不定芽及生根数量，检测并统计转基因烟草阳性转化率，其中PCR检测引物实验组为xylA基因全长上下游引物：F3：5′-ATG

CAAGCCTATTTTGACC-3′，R3：5′-TTATTTGTCGA

ACAGATAA-3′；对照组为hptⅡ基因全长上下游引物F4：5′-ATGAAAAAGCCTGAACTCACCGC-3′，R4：5′-CTATTTCTTTGCCCTCGGAC-3′。

1.2.4 杜鹃红山茶各外植体木糖筛选体系的建立

本实验借鉴山茶‘耐冬愈伤组织诱导培养基[16]，以杜鹃红山茶带柄叶片、茎段、子叶为外植体一共设计7组实验，保证30 g/L总碳源不变的情况下，将未侵染的外植体放入不同木糖浓度（0、5、10、15、20、25、30 g/L）的愈伤诱导培养基中，分别于30、30、45 d观察带柄叶片、茎段以及子叶生长状态，并且统计愈伤诱导率，确定木糖在培养基中达到筛选作用的理想浓度。

1.2.5 木糖对杜鹃红山茶愈伤组织诱导及生长的作用

利用改良的Horsch“叶盘法”[14]将带有pCAMBIA1300-xylA的农杆菌EHA105转化生长旺盛的杜鹃红山茶带柄叶片、茎段、子叶等外植体。首先将外植体预培养7 d，根癌农杆菌侵染20 min后，无菌水冲洗5次，共培养2 d，其中预培养基及共培养基组分同‘耐冬愈伤诱导培养基，然后将侵染后的外植体转移到添加5 g/L蔗糖+25 g/L木糖及200 mg/L Tim的愈伤诱导培养基中进行培养，木糖筛选；pCAMBIA1300侵染后的各外植体在添加30 g/L 蔗糖及200 mg/L Tim的愈伤诱导培养基中培养，以卡那霉素筛选作对照。观察愈伤组织出现时间、愈伤组织生长状态并统计其生长量，其中生长量统计时实验组和对照组所对应的外植体质量相同，本实验中带柄叶片总质量为5.2 g、茎段总质量为3.0 g、子叶总质量为6.5 g，实验重复3次。

2 结果与分析

2.1 xylA基因获得及其酶切验证

以提取的大肠杆菌Top10基因组DNA为模板，F1、R1为引物进行PCR扩增，获得约1.3 kb的目的条带（图1-a）。1%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收、产物连接到pGEM-T载体上，转化大肠杆菌DH5α后，XhoⅠ酶切验证重组质粒（图1-b），挑取阳性克隆测序，测序结果表明该片段大小为1 323 bp，与GenBank公布的xylA序列基本一致，表明扩增的片段为大肠杆菌xylA基因。

2.2 pCAMBIA1300-xylA重组载体的鉴定

pCAMBIA1300-xylA的重组区域如图2所示，xylA替换pCAMBIA1300载体中hptⅡ基因。由于hptⅡ基因两端酶切位点均为XhoⅠ，扩增xylA基因的上下游引物引入了XhoⅠ酶切位点，因此xylA可能以正反两种方向插入到载体上。重组载体鉴定时首先用XhoⅠ酶切验证xylA基因的插入，如图3-a初步表明1、3、4、5号有xylA基因的插入。然后在pCAMBIA1300载体CaMV35S promoter末尾端设计的一条上游引物F2，在CaMV35S polyA初始端设计一条下游引物R2，xylA基因片段正向插入时可扩增出预期1 532 bp的条带，反向插入则无条带，图3-b表明8、9、10号为xylA基因的正向插入重组子。

2.3 xylA基因对模式植物遗传转化的影响

以xylA作标记基因的实验组烟草叶盘翠绿色，10 d后愈伤组织及不定芽原基出现，15 d后不定芽分化，愈伤组织及不定芽生长健壮，表面湿润，呈碧绿色，数量也较多，不定芽移入生根培养基中7 d后生根，主根发达，侧根密集（图4）。以卡那霉素筛选的对照组叶盘浅黄色，15 d后愈伤组织出现，20 d后不定芽分化，愈伤组织及不定芽呈黄绿色，数量较实验组少，不定芽移入生根培养基中12 d后生根，主根纤细，几乎无侧根（图5）。

农杆菌侵染后，经统计实验组愈伤组织诱导率比对照组高出13%（图6-a），不定芽数量约为对照组的2.7倍（图6-b），生根30 d后发现实验组不定芽主根及侧根数约为对照组3.1倍（图6-c）。

选取20株pCAMBIA1300-xylA转基因烟草待测植株，提取基因组DNA，PCR扩增鉴定阳性植株及统计阳性率（图7），20株对照组待测植株作对照（图8）。结果发现，阳性植株实验组18株、对照组10株。经统计木糖筛选的阳性率约为卡那霉素筛选的1.8倍。

2.4 杜鹃红山茶各外植体木糖筛选浓度的优化

木糖筛选体系建立过程中发现，带柄叶片及茎段的愈伤组织出现时间较子叶提前，且生长速度也较快。3种外植体在添加不同浓度的木糖培养基中生长状态良好，随着木糖浓度的增加，愈伤组织数量逐渐递减（表1），表明木糖可以抑制愈伤组织生长，其中6号培养基即木糖和蔗糖浓度比为25 g/L：5 g/L时，外植体的愈伤诱导率骤减，利用SPSS19.0软件进行多组样本间差异显著性分析发现6号与1～5号培养基下的愈伤诱导率均呈显著差异，p﹤0.05，说明此浓度比可以有效抑制各外植体形成愈伤组织，该木糖浓度可以作为理想筛选浓度。当木糖和蔗糖浓度比达30 g/L：0 g/L时（即7号培养基），与1～6号培养基中的愈伤诱导率进行分析，也发现均呈显著差异，然而7号培养基完全抑制愈伤组织形成，因此不适合作为理想筛选浓度。

观察图9-a、b、c可以发现，带柄叶片、茎段和子叶均在6号培养基中即木糖和蔗糖浓度比为25 g/L∶5 g/L，愈伤组织生长明显减少，7号培养基即30 g/L∶0 g/L时，无愈伤组织形成，更加说明木糖浓度为25 g/L时对外植体能够有效的起到筛选作用。另外，经观察还发现，含少量木糖的培养基（如2、3号培养基）中的愈伤组织比1号全蔗糖培养基的组织质地较幼嫩、疏松。

2.5 木糖筛选系统对杜鹃红山茶愈伤诱导及生长的作用

实验组pCAMBIA1300-xylA侵染后的杜鹃红山茶带柄叶片、茎段约15 d 出现愈伤组织，25 d观察愈伤生长量，发现带柄叶片的愈伤量较茎段的少（图10 a-Test、b-Test）；子叶约20 d才有愈伤出现，40 d后观察愈伤生长量，子叶盘边缘及表面均出现愈伤，愈伤组织泛红，表面湿润、疏松（图10-c-Test）。对照组pCAMBIA1300侵染后的带柄叶片、茎段在15 d时，只有极少量愈伤出现，25 d时带柄叶片主脉及伤口处才膨化（图11-a-CK），茎段顶端及叶柄处出现少量愈伤（图10-b-CK）；对照组子叶20 d几乎无愈伤出现，40 d时只有边缘有愈伤组织生长，质地紧密，较少泛红，中间无愈伤且干涩（图10-c-CK）。农杆菌侵染50 d后，带柄叶片、茎段、子叶的愈伤生长量分别为对照的1.8倍、2.5倍、1.5倍（图11）。由此推测，木糖筛选系统对杜鹃红山茶茎段愈伤组织的生长效果最好，其次为带柄叶片，最后为子叶。

3 讨论与结论

本研究以xylA为筛选标记，在烟草遗传转化过程中以15 g/L木糖作筛选浓度，获得的转化体比对照组生长更旺盛，愈伤组织诱导及不定芽萌发更早，其中愈伤组织诱导率比对照组约高出13%，不定芽及生根数量分别为对照的2.7倍和3.1倍。更为重要的是转基因烟草阳性率提高近1倍。这些结果表明，xylA基因在本研究中能够代替抗生素起到高效的筛选作用，因此木糖筛选系统在模式植物烟草遗传转化过程中是可行的。虽然有研究认为，以xylA作标记基因，以木糖作为唯一碳源来筛选转化烟草细胞时，其筛选效果不如卡那霉素筛选系统[17]。其可能的原因是木糖作唯一碳源对植物细胞生长有毒害作用。在黄瓜及马铃薯的研究中发现木糖为唯一碳源时，外植体褐化死亡率较高，成苗率更低[13，18]。因此在木糖作筛选标记时，应避免以木糖作为唯一碳源。

本研究成功建立了杜鹃红山茶带柄叶片、茎段、子叶等外植体的木糖筛选系统。在30 g/L总糖的培养基中，25 g/L木糖+5 g/L蔗糖及30 g/L木糖的浓度均抑制了3种不同外植体愈伤组织的生长，表明木糖筛选的理想浓度与杜鹃红山茶外植体的种类无关。实验过程中还发现5 g/L木糖+25 g/L蔗糖及10 g/L木糖+20 g/L蔗糖组合相对于0 g/L木糖+30 g/L蔗糖组合所诱导的愈伤组织颜色均翠绿，可能是因为全蔗糖培养基中愈伤组织生长较快，组织易泛白、老化，而低浓度的木糖对愈伤组织生长仅有轻微抑制作用，愈伤组织细胞一直处于快速分裂状态，这有利于后期不定芽的诱导。由于以木糖为单一碳源对植物细胞有毒害作用，我们认为25 g/L的木糖浓度可作为杜鹃红山茶理想的筛选浓度，这与黑麦草的研究结果一致[19]。考虑到本实验仅设定了7种木糖浓度，在后续的实验中仍需将梯度进一步细化以获取更为优化的木糖筛选浓度。玉米、花生遗传转化过程中发现合适的木糖筛选浓度更为宽泛[11-12]。因此还需要考虑不同物种对木糖耐受力的情况，优化其木糖最佳筛选浓度应用于遗传转化体系中。

大量研究发现，农杆菌介导的遗传转化过程中抗生素会抑制愈伤组织生长、不定芽分化，从而影响很多物种遗传转化的稳定建立，在木本植物中更是如此。在杨树、刺槐、桑树及桉树等木本植物的遗传转化过程中，发现愈伤组织对卡那霉素极为敏感，严重时愈伤组织很快褐变死亡，少有不定芽的成功分化[6，20-21]。一些藤本植物葡萄组织对卡那霉素也非常敏感，即使在相对较低的浓度时，也会抑制组织再生[22]。草本花卉植物，如非洲菊，对卡那霉素及潮霉素也非常敏感，随着抗生素浓度的增加，获得的愈伤组织越来越少且状态不佳，不定芽分化也明显下降，甚至整个外植体褐变加剧而死亡[23]。对抗生素敏感的植物而言，可以考虑选用糖类筛选系统，应用于遗传转化系统中。本实验将木糖筛选系统初步应用到杜鹃红山茶遗传转化体系建立中，以xylA作筛选标记时愈伤诱导天数提前约5 d，转化体生长状态良好，愈伤组织数量也较多，为卡那霉素筛选的1.5～2.5倍，虽然没有烟草那么明显，但优化后的木糖筛选系统是适合于杜鹃红山茶再生体系的。

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