巴西橡胶树HbMET的克隆与表达分析

李辉亮　郭冬　汪晗　杨子平　彭世清

摘 要 通过同源克隆和RACE方法获得了巴西橡胶树DNA甲基转移酶（DNA Methyltransferase， MET）基因（HbMET）。HbMET长4 896 bp，含有4 635 bp的阅读框架，编码1 545个氨基酸。蛋白分子量174.36 ku，等电点为6.36。氨基酸序列与可可、毛果杨、黄瓜、拟南芥、碧桃、葡萄和烟草等物种的MET家族成员的同源性分别为73%、77%、74%、56%、72%和68%。进化树分析表明，HbMET氨基酸序列与毛果杨的MET亲缘关系最近。HbMET在巴西橡胶树的根、树皮、叶、胶乳中均有表达，其中在胶乳中表达量最低；HbMET在橡胶树自根幼态无性系的胶乳中表达比老态无性系胶乳中的表达低。

关键词 巴西橡胶树；自根幼态无性系；DNA甲基转移酶；表达；DNA甲基化

中图分类号 S794.1 文献标识码 A

目前生产中种植的橡胶树是通过对优良品种嫁接获得的，由于在嫁接过程中所用的砧木是未经选择的实生苗，同时嫁接后由于砧木和接穗的相互作用，造成种植的橡胶树会出现不同个体之间生长的差异和产胶的差异[1-3]。中国学者首次以橡胶树花药为外植体通过体细胞发生途径获得了再生植株[4-5]。由于再生植株具有自己的根系，摆脱了砧木的影响并恢复了幼态的特性，称为自根幼态无性系[2，6]。与嫁接苗相比，自根幼态无性系具有生长速度快、干胶产量高、抗逆性强的特点[6-9]。自根幼态无性系与供体（老态无性系）差异产生的原因尚不清楚。以前对差异产生的原因研究主要集中在形态学观察、排胶生理参数等方面，如树的茎围、乳管层数、堵塞指数和黄色体破裂指数、胶乳中糖、无机磷含量和干胶含量等，综合相关研究结果，自根幼态无性系高产的构成因子主要有：较快的生长速度、较多的乳管列数目、较好的排胶和产胶生理特性[6-9]。本课题组研究发现在自根幼态无性系的胶乳和老态无性系的胶乳中存在一些基因和蛋白的差异表达，初步证实了在自根幼态无性系中胶乳上调表达的基因有95个，下调表达的基因有26个，同时发现在橡胶树自根幼态无性系中13个蛋白上调表达，11个蛋白下调表达[10-15]。推测这些基因和蛋白的差异表达是自根幼态无性系和老态无性系的产量差异产生的根本原因。橡胶树自根幼态无性系是由供体通过无性繁殖获得的，自根幼态无性系和供体的遗传背景是相同的，所含遗传物质DNA在碱基序列是相同的，正常条件下橡胶树的无性繁殖不可能改变遗传物质DNA的碱基序列，因此自根幼态无性系与其供体差异的产生很可能与表观遗传相关。李辉亮[16]证实了橡胶树自根幼态无性系与供体基因组DNA之间存在甲基化多态性的差异，进一步表明自根幼态无性系与其供体差异的产生与表观遗传相关。

表观遗传是指不因DNA序列的变化而形成基因功能的改变，这种改变是细胞内除了遗传信息以外的其他可遗传物质发生的改变，且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递[17]。表观遗传的分子机制包括DNA甲基化，组蛋白修饰，染色质改型和小RNA干扰等。甲基化是DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现，是调节基因功能的重要手段[18]。它通过一系列DNA甲基转移酶来建立和维持DNA甲基化模式[19]。在植物中目前发现至少有MET甲基转移酶（Methyltransferase， MET）、染色质甲基化酶（Chromomethylase， CMT）和域重排甲基转移酶（Domains Rearranged Methyltransferase， DRM）3类在结构和功能上不同的胞嘧啶甲基转移酶[19-27]。为了研究橡胶树自根幼态无性系高产与DNA甲基化的关系，本课题组对橡胶树的3类胞嘧啶甲基转移酶基因进行了克隆和表达分析等相关研究。本研究将报道巴西橡胶树DNA甲基转移酶（Methyltransferase， MET）基因（HbMET）的克隆和表达，该结果为进一步研究橡胶树自根幼态无性系高产与DNA甲基化的关系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）海垦2号自根幼态无性系及其供体老态无性系种植在中国热带农业科学院试验场。所用胶乳的采集按照Tang等[28]的方法进行。根、叶和树皮采集后用液氮研磨，保存于-70 ℃备用。

1.1.2 质粒、菌种及试剂 3′-full RACE试剂盒和RNA PCR（AMV）Ver.3.0试剂盒购自TaKaRa公司。Taq DNA Polymerase 和T4-DNA连接酶dNTPs、IPTG、X-gal购于Promega公司。E.coli DH5α菌株由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 参照Tang等[28]的方法进行。

1.2.2 HbMET的扩增 根据已报道的植物MET基因家族保守序列设计简并引物，通过PCR获得HbMET片段序列，再根据HbMET片段序列设计3′RACE引物。cDNA的合成和3′RACE扩增按照3′-full RACE试剂盒使用说明书进行。实验所用引物见表1。

1.2.3 HbMET同源性分析和进化树构建 利用DNAMAN软件分析HbMET蛋白与其它植物MET家族的同源性和进化树构建。

1.2.4 HbMET定量PCR分析 以HbACT基因为内参对照，采用SYBR Premix Ex TaqⅡ进行定量PCR分析，基因的相对表达量按BIO-RAD CFX96荧光定量仪使用说明进行分析。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s， 60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，35个循环。PCR引物见表2。

2 结果与分析

2.1 HbMET的克隆

根据已有植物的MET基因家族保守序列设计简并引物，通过PCR获得了HbMET的3个片段，分别为1 725 bp（HbMET1）、1 584 bp（HbMET2）和1 525 bp（HbMET3）（图1）。利用DNAMAN软件对这3个片段进行拼接。根据拼接获得的片段设计3′RACE引物，通过3′-RACE扩增技术得到一个551 bp的 3′片段（图1）。将保守区片段与3′端片段进行拼接，得到一个长4 896 bp的序列（命名为HbMET）。该序列含有4 635 bp的开放式阅读框架，3′端有248 bp的非编码区，其中含有一条18个碱基的polyA尾，预测该基因编码1 545个氨基酸（图2），分子量174.36 ku，等电点为6.36。

2.2 HbMET生物信息学分析

将HbMET氨基酸序列与其它植物的MET比较，发现HbMET与可可（Theobroma cacao）、毛果杨（Populus trichocarpa）、黄瓜（Cucumis sativus）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、碧桃（Prunus persica）、葡萄（Vitis vinifera）和烟草（Nicotiana tabacum）等物种的MET家族成员的同源性分别达到为73%、77%、74%、56%、72%和68%（图3）。构建的进化树表明，HbMET与毛果杨的MET亲缘关系最近（图4）。

2.3 HbMET在自根幼态无性系组织特异性表达

对HbMET在自根幼态无性系的根、皮、花、叶和胶乳中的表达进行了定量PCR分析，结果表明，HbMET在根中的表达最高，其次是在叶和树皮中表达，胶乳中表达量最低（图5）。

2.4 HbMET在自根幼态无性系与其供体胶乳的差异表达

天然橡胶是在橡胶树的乳管中合成的，胶乳实质上是乳管细胞的细胞质[29]。乳管细胞中基因的表达与天然橡胶生物合成直接相关。为了解HbMET在自根幼态无性系与其供体胶乳的表达是否存在差异，对HbMET在自根幼态无性系和其供体胶乳的进行定量PCR分析， 结果表明，HbMET在自根幼态无性系的表达比其供体胶乳的表达低（图6）。

3 讨论与结论

DNA甲基化是最早发现的表观遗传修饰途径之一，大量研究结果表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达[17]。DNA甲基化主要是通过DNA甲基转移酶家族来催化完成的[19-21]。目前一些植物的MET基因已经克隆并进行了相关研究[21-23]，但是到目前为止还未见橡胶树MET基因研究的报道。本研究首次从橡胶树中克隆了MET基因HbMET，同源性和分子进化分析表明，推导的HbMET是一种与植物DNA甲基化相关的甲基化酶。过去关于巴西橡胶树自根幼态无性系和供体差异产生的原因的研究主要集中在对自根幼态无性系高产构成的形态和生理指标[6-9]，以及胶乳中差异表达基因和蛋白的鉴定[10-15]。而从表观遗传的角度来分析自根幼态无性系和供体差异有可能阐明自根幼态无性系高产产生的根本原因。天然橡胶是橡胶树乳管细胞中合成的，胶乳是乳管细胞的细胞质[29]。本研究结果表明，HbMET在自根幼态无性系胶乳中的表达比其供体胶乳的表达低，可能在自根幼态无性系乳管细胞中DNA甲基化程度较供体乳管细胞的低，DNA甲基化可调控特定的基因表达，而植物启动子区的DNA甲基化通常抑制转录[21-22]。推测由于自根幼态无性系和供体乳管细胞中DNA甲基化的差异，使得自根幼态无性系和供体乳管细胞中基因的表达出现差异，从而导致巴西橡胶树自根幼态无性系和供体在产胶能力等方面的差异，但这一推测还需进一步深入研究。

参考文献

[1] Clément-Demange A， Priyadarshan P M， Hoa T T T， et al. Hevea rubber breeding and genetics[J]. Plant Breeding Reviews， 2007， 29： 177-281.

[2] Chandrashekar T R， Mydin K K， Alice J， et al. Intraclonal variability for yield in rubber（Hevea brasiliensis）[J]. Ind J Nat Rubb Res， 1997， 10： 43-47.

[3] Hua Y W， Huang T D， Huang H S. Micropropagation of self-rooting juvenile clones by secondary somatic embryogenesis in Hevea brasiliensis[J]. Plant Breeding， 2010， 129： 202-207.

[4] 中国科学院遗传研究所， 广东省农垦总局保亭热带作物研究所. 三叶橡胶（Hevea brasiliensis）花药育株成功（简讯）[J]. 遗传学报， 1977， 4： 186.

[5] 王泽云， 曾宪松， 陈传琴. 从离体花药诱导巴西橡胶植株[J]. 热带作物科技通讯， 1978， 4： 1-7.

[6] 陈雄庭， 王泽云， 吴蝴蝶， 等. 橡胶树新种植材料-幼态自根无性系[J]. 热带作物学报， 2002， 23： 19-23.

[7] 幼态课题组. 幼态无性系在生产上的应用[J]. 热带农业科学， 1994， 14（2）： 1-3.

[8] 郝秉忠， 吴继林. 巴西橡胶树幼态无性系的高产特性[J]. 热带农业科学， 1996， 16（2）： 1-8.

[9] 王泽云， 陈雄庭， 吴胡蝶. 橡胶树新型种植材料--体胚植株[J]. 热带农业科学， 2001， 21（6）： 11-15.

[10] 鲁惠中， 李辉亮， 郭 冬， 等. 巴西橡胶树HbHDT1基因的克隆及表达分析[J]. 热带作物学报， 2010， 31（1）： 59-64.

[11] 李辉亮， 郭冬， 彭世清. 巴西橡胶树14-3-3蛋白基因的克隆及表达分析[J]. 热带作物学报， 2010， 31（8）： 1 452-1 457.

[12] 梁小莲， 李辉亮， 彭世清. 巴西橡胶树TCTP基因的克隆及表达[J]. 分子植物育种， 2009， 7： 188-193.

[13] Li H L， Guo D， Peng S Q. Differential gene expression profiles in latex from Hevea brasiliensis between self-rooting juvenile and donor clones[J]. Plant Growth Regulation， 2014， 74： 65-71.

[14] Li H L， Guo D， Lan F Y， et al. Protein differential expression in the latex from Hevea brasiliensis between self-rooting juvenile clones and donor clones[J]. Acta Physiol Plant， 2011， 33： 1 853-1 859.

[15] Li H L， Lu H Z， Guo D， et al. Molecular characterization of a thioredoxin h gene（HbTRX1）from Hevea brasiliensis showing differential expression in latex between self-rooting juvenile clones and donor clones[J]. Mol Biol Rep， 2011， 38： 1 989-1 994.

[16] 李辉亮. 橡胶树自根幼态无性系与其供体（老态无性系）差异的分子基础研究[D]. 海口： 海南大学， 2010.

[17] Russo V E A， Martienssen R A， Riggs A D. Epigenetic mechanisms of gene regulation[M]. New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1996： 123-130.

[18] Zemach A， McDaniel I E， Silve P， et al. Genome-wide evolutionary analysis of eukaryotic DNA methylation[J]. Science， 2010， 328： 916-919.

[19] Goll M G， Bestor T H. Eukaryotic cytosine methyltransferases[J]. Annual Review Biochem， 2005， 74： 481-514.

[20] Finnegan E J， Kovac K A. Plant DNA methyltransferases[J]. Plant Mole Biol， 2000， 43： 189-201.

[21] Pavlopoulou A， Kossida S. Plant cytosine-5 DNA methyltransferases： structure， function and molecular evolution[J]. Genomics， 2007， 90： 530-541.

[22] Kishimoto N， Sakai H， Jackson J， et al. Site specificity of the Arabidopsis METI DNA methyltransferase demonstrated through hypermethylation of the SUPERMAN locus[J]. Plant Mol Biol， 2001， 46： 171-183.

[23] Chan S W， Henderson I R， Jacobsen S E. Gardening the genome： DNA methylation in Arabidopsis thaliana[J]. Nature Reviews Genetics， 2005， 6： 351-360.

[24] Henikoff S， Comai L. A DNA methyltransferase homolog with a chromodomain exists in multiple polymorphic forms in Arabidopsis[J]. Genetics， 1998， 149： 3 007-3 018.

[25] Cao X， Springer N M， Muszynski M， et al. Conserved plant genes with similarity to mammalian de novo DNA methyltranferases[J]. Proc Nat Acad Sci USA ， 2000， 97： 4 979-4 984.

[26] Cao X， Jacobsen S E. Role of the Arabidopsis DRM methyltransfeases in de novo methylation and gene silencing[J]. Current Biol， 2002， 12： 1 138-1 144.

[27] Chan S W， Zilberman D， Xie Z， et al. RNA silencing genes control de novo DNA methylation[J]. Science， 2004， 303： 1 336.

[28] Tang C， Qi J， Li H， et al. A convenient and efficient protocol for isolating high-quality RNA from latex of Hevea brasiliensis（para rubber tree）[J]. Biochem Biophys Methods， 2007， 70： 749-754.

[29] Kush A. Isoprenoid biosynthesis： the Hevea factory[J]. Plant Physiol Biochem， 1994， 32： 761-767.