抗番鸭细小病毒卵黄抗体的制备

赵瑞宏等

摘要[目的]有效预防和治疗番鸭细小病毒病。[方法]用番鸭细小病毒连续免疫产蛋母鸡3次，收集鸡蛋，并制备出高免卵黄抗体。通过琼脂扩散试验对制备的卵黄抗体进行效价测定，用雏番鸭进行中和与治疗试验。[结果]制备的卵黄抗体琼扩效价达到1∶32，能有效中和番鸭细小病毒对雏番鸭的致病性，对发病的雏番鸭有很好的治疗作用。[结论]该研究为番鸭细小病毒的预防和治疗提供了一种有效的生物制品。

关键词番鸭细小病毒；卵黄抗体；制备

中图分类号S858.32文献标识码A文章编号0517-6611（2015）29-062-03

番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus，MDPV）为细小病毒科、细小病毒属的成员，病毒直径20～24 nm，无囊膜，呈二十面体对称，基因组大小约5 kb。主要引起1～3周龄雏番鸭发病，以腹泻、软脚、喘气为特征，发病率为27%～62%，病死率为22%～43%，且病愈鸭大部分成为僵鸭。随着安徽省番鸭养殖量的增加，番鸭细小病毒病也时有发生。研究表明，IgY是一种高效、特异的抗体，且方便、廉价。为了有效防治番鸭细小病毒病，笔者制备了抗番鸭细小病毒卵黄抗体，通过试验发现其对番鸭细小病毒病起到了明显的预防和治疗作用。

1材料与方法

1.1试验材料

番鸭细小病毒AH株，由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所分离、鉴定并保存。番鸭胚和雏番鸭，从非疫区购回番鸭种蛋，自行孵化。高产蛋鸡为购自安徽省肥西县某鸡场饲养的200日龄、健康的京红1号商品代蛋鸡。营养琼脂和血琼脂培养基，均购自北京奥博星生物技术有限公司；氯仿、琼脂糖、氯化钠均为国产分析纯。

1.2试验方法

1.2.1病毒培养。

将MDPV AH株病毒液经尿囊腔接种12日龄番鸭胚，0.1 ml/胚，37 ℃下孵育，每天观察2次至第5天，弃去24 h内的死胚，收集24～120 h内死亡的鸭胚尿囊液，置于-80 ℃冰箱中冻存备用。

1.2.2病毒ELD50测定。

将病毒用生理盐水进行连续10倍系列稀释，每个稀释度接种4枚12日龄番鸭胚，0.1 ml/胚，37 ℃条件下孵化，弃去24 h内的死胚，每天照蛋2次，连续观察5 d，采用ReedMuench法计算ELD50。

1.2.3产蛋鸡免疫。

取100只非免疫产蛋鸡隔离饲养，用实验室保存的MDPV AH 株病毒液（ELD50为10-5.5/0.1 ml），每只鸡胸肌注射 0.2 ml 进行首免；14 d后进行2次免疫，每只鸡胸肌注射 0.5 ml；28 d进行第3次免疫，每只鸡胸肌注射 1.0 ml。三免后14 d收集鸡蛋。免疫期间，统计免疫前后的产蛋率。

1.2.4高免卵黄抗体的制备与纯化。

参照文献

方法，取高免鸡蛋洗净并消毒，取出卵黄，收集卵黄液。将卵黄液用灭菌生理盐水按1∶5的比例稀释、混合、搅拌均匀，加入等体积的氯仿，充分振荡后5 000 r/min 离心10 min，收集上层水相，置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2.5无菌检验。

分别取0.2 ml纯化的卵黄抗体接种于营养琼脂培养基和血琼脂培养基。将培养基置于37 ℃条件下培养观察3～5 d。

1.2.6抗体安全性检测。

取纯化的卵黄抗体，分别经肌肉注射和口服途径接种3日龄雏番鸭各5只，接种剂量为1 ml/只，同时取5只3日龄雏番鸭接种生理盐水作为对照。各组隔离饲养，观察并记录各组雏番鸭生产性能。

1.2.7琼扩抗原的制备。

取MDPV AH株胚胎尿囊液20 ml，5 000 r/min离心10 min，取上清分装于7 ml玻璃瓶中，每瓶2 ml进行冻干备用。

1.2.8琼脂扩散效价的测定。

称取1 g琼脂糖置于100 ml 8%NaCl 溶液中，加热融化后倒入玻璃培养皿中制成琼脂扩散平板，冷却后用打孔器打成梅花状小孔，各孔用融化的琼脂糖补底。置于 4 ℃下冷却，取制备的冻干琼扩抗原1瓶，用200 μl超纯水溶解，取 50 μl加入中间孔，外周孔依次加入倍比稀释的纯化卵黄抗体50 μl。将加样后的琼脂扩散平板放入湿盒内置37 ℃温箱扩散24～48 h。

1.2.9中和与治疗试验。

将30只3日龄雏番鸭随机分成3组，每组10只。取纯化的卵黄抗体1 ml与等量病毒液（ELD50为10-5.5/0.1 ml）混匀，37 ℃下作用1 h，肌肉注射第1组雏番鸭，0.2 ml/只；取生理盐水与等量病毒液混匀，37 ℃下作用1 h，肌肉注射第2组和第3组雏番鸭，0.2 ml/只；第3组雏番鸭在接毒后 96 h每只皮下注射纯化的卵黄抗体0.5 ml。各组分开隔离饲养观察10 d，记录各组发病和死亡情况。

2结果与分析

2.1病毒的培养

12日龄番鸭胚经尿囊腔接种MDPV AH株病毒液后于86～96 h死亡，死亡胚胎尿囊液澄清透明。

2.2病毒的ELD50

病毒进行连续10倍系列稀释后接种番鸭胚，5 d内番鸭胚死亡情况见表1。

采用ReedMuench法，d=（80-50）/（80-20）=0.5，ELD50的對数为-5+0.5×（-1）=-5.5，ELD50=10-5.5/01 ml。

2.3产蛋鸡免疫

100只产蛋母鸡接种后采食、产蛋正常，没有不良反应。

2.4无菌检验结果

接种卵黄抗体的营养琼脂培养基和血琼脂培养基经37 ℃培养5 d，取出观察发现无细菌生长。

2.5抗体安全性检测结果

3日龄雏番鸭经肌肉注射和口服途径接种的试验组和接种生理盐水的对照组雏番鸭的生产性能无明显差异。

2.6琼脂扩散效价的测定

24 h后取出琼脂扩散平板观察，在抗原抗体孔之间有明显沉淀线，抗体效价达1∶32。

2.7中和与治疗试验

由表2可知，第1组接种卵黄抗体与病毒混合液的雏番鸭，未出现发病症状和死亡；第2组在接种后第4天出现发病症状，第5天死亡1只，至第9天接种的10只全部死亡；第3组在接毒后第4天出现发病症状，注射卵黄抗体后第2天死亡1只，其余9只恢复正常。

3小结与讨论

（1）笔者成功制备出抗番鸭细小病毒卵黄抗体，卵黄抗体琼脂扩散效价达1∶32，对发病的雏番鸭有明显的治疗作用，能有效中和番鸭细小病毒。

（2）番鸭细小病毒病与其他细小病毒一样以体液免疫为主，通过母源抗体可使雏番鸭获得被动保护，规模化番鸭场种鸭使用MDPV疫苗，其子代雏番鸭可获得母源抗体的保护而不发病，但一些养鸭场常出现疫苗免疫效果不甚理想或免疫失败现象，用卵黄抗体可进行有效预防和治疗，为番鸭细小病毒病的预防和治疗提供了一种新药物。

（3）在琼脂扩散抗原的制备过程中，采用冻干的方法进行10倍浓缩，浓缩的抗原与抗体能特异性结合形成沉淀线，冻干的抗原也易于保存。

（4）在病毒培养和ELD50测定时，番鸭胚在接种MDPV AH株病毒液后86～96 h即发生死亡，说明分离毒株的毒力强。

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