甜瓜白粉病离体叶片接种方法研究

邓丽君　廖新福　王惠林　户金鸽　杨军　杨咪

摘要：为了明确新疆吐鲁番地区甜瓜白粉病生理小种，试验采用离体叶片和活体植株2种接种方法，对国际通用的甜瓜白粉病生理小种鉴定的13份鉴别寄主，即MR-l、WMR 29、Iran H、Vedrantais、Edisto 47、Topmark、Nan-tais Oblong、PMR6、PMR5、PMR45、P1124111、P1124112、P1414723进行抗病性鉴定。结果表明，2种鉴定方法在发病率和病情指数上有些差异，但鉴定结果基本一致，初步确定新疆吐鲁番地区的甜瓜白粉病由Podosphaera xanthii的小种l所致。因此，离体叶片接种方法可用于甜瓜白粉病生理小种的鉴别和抗源鉴定。

关键词：甜瓜；白粉病；离体叶片；抗性鉴定；种质资源

甜瓜（Cucumis melo L）是葫芦科黄瓜属一年生蔓性草本植物。因其栽培周期短、效益高，是致富首选经济作物之一。甜瓜白粉病是甜瓜生产上最常见、最重要的气传病害，从苗期到成株期均可发生，但进入中后期最为严重，主要危害叶片，严重时亦可危害叶柄和茎蔓。还可导致植株冠层减少，单株坐果率降低，发病严重年份可使甜瓜减产50%以上，且甜瓜的成熟度和含糖量也会受到很大的影响。

甜瓜白粉病是由子囊菌亚门白粉菌科白粉菌属的真菌侵染所致，甜瓜白粉病菌主要为单囊壳白粉菌（Podosphaera xanthii）和二孢白粉菌（Golorino-myces cichoracearum）。国内有关甜瓜白粉病病原菌鉴定结果均表明我国甜瓜白粉病是P.xanthii所致，王娟等嘲初步确定北京地区瓜类蔬菜白粉病由P.xanthii所致，张学军等报道新疆甜瓜白粉病由P.xanthii所致。甜瓜白粉菌的小种多，分化快，至今已发现P.xanthii存在11个生理小种，即：0、1、2U.S、2France、3、4、5、N1、N2、N3、N4 E4-61。Kuzuva等将N1和N2定名为小种6和小种7；G cichoracearum的生理小种有2个，即小种0和小种1。

防治甜瓜白粉病常用的方法是化学防治法，但化学防治不仅成本高、效率低，还会引起病原菌的抗药性以及环境污染等问题。多年的防治实践表明，利用抗源培育抗病品种则是防治甜瓜白粉病最经济、最有效的措施。培育抗病品种的关键步骤之一是生理小种的明确和抗病性的鉴定。由于白粉菌是一种专性寄生菌，只能在活体寄主上存活，目前甜瓜白粉病生理小种的鉴定多采用国际通用的13份鉴别寄主在其苗期使用分生孢子悬浮液喷雾接种法。而苗期喷雾接种受温度和湿度等外界环境因素的影响较大，常造成鉴定结果不稳定，不能完全反映抗病育种材料的抗性程度。多项研究表明，利用植株离体叶片进行室内抗性接种鉴定，具有快速、准确、筛选量大以及不受季节限制等优越性。而甜瓜白粉病利用离体叶片接种方法鲜有报道。本研究主要探索甜瓜白粉病离体叶片的接种方法，以期为甜瓜白粉病生理小种的鉴别和抗源材料的鉴定提供理论依据。

1.材料与方法

1.1材料

当地易感白粉病甜瓜品种‘巴登的叶片。鄯善当地温室采集的白粉菌。国际通用的甜瓜白粉病生理小种鉴定的一整套13份鉴别寄主，即MR-1、WMR 29、Iran H、Vedrantais、Edisto 47、Top-mark、Nantais Oblong、PMR6、PMR5、PMR45、P1124111、P1124112、P1414723。所有供试材料均由新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所提供。离体接种试验的材料播种于光照培养箱，活体植株接种试验的材料播种于隔离温室。

1.2方法

1.2.1病原茵和分生孢子悬浮液制备待感病品种长到3片真叶时，从鄯善温室采集白粉病发病合适的甜瓜叶片，放入冰盒，带回实验室处理。取下感病品种的叶片，留有0.5 cm长的叶柄，用剪刀斜切，自来水冲洗2次，然后用75%（φ）的乙醇浸泡10s，再用蒸馏水晃洗2次，置于7%（ω）次氯酸钠浸泡消毒10min，然后用无菌水冲洗2次。在超净工作台将叶片置于铺有灭过菌的滤纸的培养皿里，待水吸干后，将叶柄插入装有培养基的三角瓶中。参考李映霞配制培养基（5‰琼脂，50mg·Lω^-1苯丙咪唑）。接种前用4℃无菌水将甜瓜叶片上的孢子配制成1×10⁵个·mL^-1的孢子悬浮液。用移液枪取20μL菌液均匀的接种于叶片正面。放入光照培养箱，在白天25℃，晚上20℃、湿度70%、12h光暗交替的条件下培养。接种7d后，观察发病情况。待发病充分后，取出病叶，将少量4℃灭过菌的蒸馏水冲洗成孢子悬浮液，在显微镜下调整分生孢子悬浮液的浓度约为1×10⁵个·mL^-1备用。

1.2.2不同寄主的离体叶片鉴定取13份国际通用的白粉病生理小种鉴别寄主展开的幼叶（第3-第4片叶），在超净工作台内，灭菌打孔器将叶片打成1.5cm叶碟，将消毒过的叶碟放人高温灭菌后的平板培养基中。每个品种处理10片幼叶，3次重复，用移液枪取10μL配置好的菌液接种于叶片正面中心。用封口膜封住培养皿边口后，放人培养箱培养，在白天25℃，晚上20℃、湿度70%、12h光暗交替的条件下培养。接种7d后开始观察记录，在15-20d充分发病后调查发病率和病情指数。离体叶盘法病情分级标准参考刘爱媛的方法，略有修改（表1，表2）。根据调查结果按公式计算出病情指数（DI）：

1.2.3不同寄主的活体植株接种鉴定将13份白粉病鉴别寄主播种于隔离温室，各5株，3次重复。长到5片真叶时，采用孢子悬浮液喷雾接种法，选在傍晚时间接种。接种时用软刷将新鲜分生孢子刷人无菌蒸馏水中，加入一滴Tween-20（使之质量分数为0.05%）搅拌均匀，孢子悬浮液的浓度为1×10⁵个·mL^-1，用喷雾器把孢子悬浮液均匀喷雾接种到13个鉴别寄主植物叶片表面，注意叶片不能滴水，接种时间严格控制在1h以内，黑暗保湿24h，温度控制在白天不超过30℃，夜间20℃，相对湿度控制在60%。70%。7d后开始观察记录，15～20d充分发病后调查发病情况，进行抗感鉴定。分级标准按照《中国蔬菜病虫预测预报》的方法”（表3，表4）。

病情指数计算公式同上。

2.结果与分析

2.1病原菌纯化和无性阶段形态鉴定

三角瓶中的完整叶片生长良好，叶片基本绿色，接种20d后，白色病斑开始连接成片，没有杂菌，表明甜瓜白粉病菌的分生孢子能够在感病品种的离体叶面正常萌发并进一步侵染（图版-1、2）。用灭过菌的接种针挑取少量的粉末在显微镜下观察，发现大量的椭圆形的分生孢子，有发达的纤维体，进一步证实了白粉菌没有受到污染，且孢子活性较强，适合接种。表明所接种的白粉菌为P.xan-thii。

2.2鉴别寄主离体叶片接种结果

13份寄主离体叶片接种后，部分寄主的叶片先后出现了不同程度的感染，各品种间的发病率和发病指数各异。根据鉴别寄主鉴定情况（图版-3-15）和鉴定结果（表5）可知，其中Iran H、Vedrantais、Topmark、Nantais Oblong表现为感病，且发病率高；P1124111、P1124112和P1414723虽有发病，但发病率低，表现为抗病；P1124111和P1124112病情指数接近感病；其余品种没有出现感病现象，均表现为抗病。表5对照甜瓜白粉病生理小种的鉴别寄主及其抗感反应可知，此次采集的白粉病菌为P.xanthii的小种1。

2.3鉴别寄主活体植株接种结果

从表6可以看出，活体植株接种的抗病性鉴定结果与离体接种结果基本一致。但发病率、发病速度和发病程度均高于离体叶片。Iran H、Vedrantais和Topmark发病最为严重，表现为高感。NantaisOblong表现为中感。其中P1124111、P1124112、P1414723接种后叶片有发病情况，但发病速度和发病程度均明显低于其他感病品种，P1414723最后发病。这与离体接种情况表现一致。其他品种没有出现感病情况，均表现为抗病。对照甜瓜白粉病生理小种的鉴别寄主及其抗感反应表可知，此次采集的白粉病菌主要是P.xanthii的小种1。

3.讨论与结论

近年来随着甜瓜种植面积的增加和设施栽培的发展，白粉病已成为甜瓜主要病害，并呈现生理小种多、分化快的特点。广泛搜集甜瓜种质资源、筛选抗源、培育和推广抗病品种是防御白粉病的一条最安全、经济、有效的途径，而准确预测甜瓜白粉病菌的种类及其分化和抗病性的鉴定，是开展甜瓜白粉病防治、引进抗源材料和选育抗病品种的基础。

目前比较常用的人工接种方法是苗期喷雾接种法，但苗期喷雾接种法对发病条件要求严格，当栽培季节或环境不适宜时植株不发病或发病不整齐，对抗性鉴定的准确性有一定的影响。此外，苗期接种周期较长，所需成本较高，无法鉴定数量较多的个体植株。郑耘研究表明，叶碟保存法具有保存菌种纯度高，不易受污染，无需隔离设备，不受试验条件限制等优点。张海旺等”圳研究表明水稻叶片划伤接种是一种准确、稳定和方便的稻瘟菌接种方法，可用于大规模定性测定水稻抗源及其后代的抗瘟基因型和稻瘟菌的致病型。王倩等研究表明利用激素处理的离体叶片进行早疫病抗性鉴定的方法受到外界环境条件影响相对较小，且需要的时间少，操作简单，可用于大量新培育马铃薯品种的抗病性初步鉴定。张永兵等研究甜瓜蔓枯病离体接种法具有检测周期短、成本低、可在有限空间鉴定大量材料的优点。离体接种法在水稻、小麦旺”、辣椒和草莓等作物的病原菌生理小种鉴别、抗源鉴定、抗性遗传规律分析和抗病品种筛选等研究中被广泛应用。

白粉病菌属于活体寄生型真菌，因此在普通培养基上无法生存。目前比较常用的人工接种鉴定方法是苗期喷雾接种法，而离体叶片接种法鲜有报道。本试验离体叶片和活体接种2种方法比较表明，活体接种的发病率及发病指数均略高于离体叶片接种，但两种方法的鉴定结果一致，新疆吐鲁番地区鄯善县温室内采集的白粉菌为P.xanthii的小种1。说明用离体叶片接种鉴定甜瓜品种的抗病性是可靠的。离体叶片接种法鉴定抗病性，具有活体整株鉴定法无法比拟的优点，并已在甜瓜蔓枯病及碗豆白粉病等病害研究中得到证实。本研究在甜瓜白粉病鉴定中也得出相似的结论。据此并结合以往的研究成果可以证明，用离体叶片接种以鉴定甜瓜白粉病的抗性，其方法可行，结果可靠。