利用多重PCR反应同时鉴定番茄Ty—3基因和抗溃疡病QTL

张建盈　严景日　杨石奇　王平勇　刘辰　沈火林

摘要：番茄黄化曲叶病毒病和番茄溃疡病是两种分布广泛、危害严重的世界性病害，严重影响了番茄的产量，是国内外番茄抗病育种的重要目标。为了提高抗病育种的效率，研究建立了抗番茄黄化曲叶病毒病Ty-3基因和抗番茄溃疡病QTL的多重PCR反应体系。该体系利用同一PCR反应，对分别与番茄抗黄化曲叶病毒病的Ty-3基因和抗番茄溃疡病的一个QTL位点Rcm5.1紧密连锁的标记进行了扩增、筛选，扩增的特异性片段与单引物扩增片段吻合。其中与Ty-3基因紧密连锁的标记Ty3F/Ty一3R为共显性标记，基因型为Ty-3/Ty-3的材料均产生630bp的特异性片段，基因型为Ty-3的材料均产生320bp的特异性条带，基因型为Ty-3/ty-3的材料产生630bp和320bp的特异性片段；与番茄溃疡病QTL位点Rcm5.1连锁的标记TG318F/TG318R为显性标记，只有抗病材料产生580bD的特异性片段，感病材料不产生特异性条带。经反复验证结果准确、稳定，可用于同—PCR反应体系中对番茄抗黄化曲叶病毒病Ty-3基因和番茄溃疡病QTL的同时筛选鉴定。

关键词：番茄；黄化曲叶病毒病；番茄溃疡病；多重PCR

番茄适应性广、产量高、富含维生素和糖类，是全世界总产量最高的30种农作物之一。番茄黄化曲叶病毒病是一种世界性病害，该病给世界上许多生产番茄的地区都带来了毁灭性的灾害，它能够使番茄的产量和品质下降，尤其是对夏秋季栽培的番茄产生更加严重的影响。所以，选育抗番茄黄化曲叶病毒病的番茄优良品种尤为重要。Ty-3基因是一个部分显性基因，被定位在6号染色体上，引物Ty-3F/Ty-3R与Ty-3基因紧密连锁。番茄溃疡病也是一种分布较为广泛，危害较为严重的细菌性病害。近年来，番茄溃疡病成为我国番茄生产的重大潜在威胁嘲。选育抗病品种是解决该病害的最佳途径。番茄溃疡病抗病基因共有Rcml.0、Rcm2.0、Rcm5.0、Rcm5.1、Rcm6.0、Rcm7.0、Rcm7.1、Rcm8.0、Rcm9.0、Rcm10.等10个QTL位点，QTL位点Rcm5.1的贡献率最高，为25.5%-27.9%。Coaker and Francis研究表明QTL位点Rcm5.1将会为番茄分子标记辅助选择抗溃疡病品种提供强有力的工具，引物TG318F/TG318R与QTL位点Rcm5.1紧密连锁。本研究利用分子标记对番茄黄化曲叶病毒病的Ty-3基因和番茄溃疡病的QTL位点Rcm5.1进行多重PCR筛选鉴定，建立同时筛选番茄Ty-3基因和番茄溃疡病QTL的多重PCR技术，以提高番茄抗病育种的分子辅助选择效率。

1.材料和方法

1.1材料

试验所用的24份番茄材料由中国农业大学番茄课题组提供，这些材料的Ty-3和溃疡病的QTL的基因型和抗病表现见表1。

1.2方法

1.2.1DNA的提取用改良的碱裂解法提取番茄基因组DNA，方法如下：首先将96孔PCR板放在事先存放在20℃冰箱的冰盒上，并用连打枪加入每孔80μL的0.05mol·L·L^-1Tris-HCL（pH7.0）十0.1 mmol·L^-1EDTA的缓冲溶液；用镊子撕取面积约为0.3 mm2的番茄叶片组织，放人另一块冰盒上的96孔PCR板中；将放人叶片的PCR板中分别每孔加入1个直径为2.5 mm的小钢珠；用连打枪在放有叶片组织的96孔板中加入100IμL0.25mol·L^-1的NaOH溶液；用硅胶垫盖在加入叶片、小钢珠和NaOH溶液的PCR板上，并放到组织研磨器中将其固定；用组织研磨器在频率70Hz、时长18s的设置下将叶片捣碎，用排枪快速吸取8，0μL研磨的组织液加入到有80μL0.05mol·L^-1Tris-HCL（pH7.0+0.1mmol·L^-1IEDTA缓冲溶液的PCR板中，用排枪吸打均匀，并用高速离心机离心，放于-20℃冰箱保存待用。此过程需要注意的是加入NaOH溶液后的操作必须在5min之内完成。

1.2.2DNA的检测

由于碱裂解法提取的基因组DNA浓度较低，不能够直接被琼脂糖凝胶电泳所检测。所以，用本实验室用来检测DNA的通用引物acting通过PCR之后再跑琼脂糖凝胶电泳检测。若PCR产物在琼脂糖上跑出230bp的条带，说明DNA能够用于做为PCR的模板DNA。PCR反应的体系为20μL，试剂及其用量如下：DNA模板1μL、2xTaq 10 MasterMix 10μL、正向引物（F）（10 pmo·L^-1μ）0.6μL、反向引物（R）（10 pmol·L^-1）0.6μL、ddH²O7.8μL。PCR的反应程序如下：95℃预变性3min；95℃30s，52℃退火30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR的反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳（加荧光染料），在电压5v，cm^-1。的条件下电泳1h，随后在Chalp Gel 15000凝胶电泳成像仪上观察并拍照分析。检测结果（图1）显示所检测的DNA都能扩增出230bp的DNA条带，能够用于PCR检测抗病性的DNA模板。

1.2.3基因Ty-3、Rcm5.1特异引物和扩增的PCR反应体系番茄抗黄花曲叶病毒病Ty-3基因的引物参照Ji等设计，番茄溃疡病的一个9TL位点Rcm5.1的连锁标记的引物TG318参照Coaker andFrancis设计。引物的序列（表2）。引物由北京三博志远生物技术有限责任公司合成。Taq酶和dNTP购自北京天根生物技术公司。2xTaq 10Mas-terMix PCR购自北京奥赛博科技发展有限公司。PCR反应的体系为20>μL，其中包括DNA模板1lxL、10xbuffer（含Mg²⁺）2μL、正向引物（F）（10pmol·L^-1）0.6μL、反向引物（R）（10pmol·L^-1）0.6μL、dNTPs（2.5mmol·L^-1）0.4μL、Taq DNA聚合酶（2.5u·μL^-1）0.4μL、ddH₂μO15μL。我们用购自北京奥赛博科技发展有限公司的2XTaq 10 MasterMix来代替10×buffer（含Mg2）、dNTPs（2.5 mmo]·L^-1）和TaqDNA聚合酶（2.5 u·L^-1），最后所加试剂及其用量如下：DNA模板1μL、2XTaq 10 MasterMixl0μL、正向引物（F）（10pmol·L^-1）0.6μL、反向引物（R）（10pom01.L^-1）0.6μL、ddH²O7.8μL。用于扩增Ty-3、Rcm5.1，基因的反应程序如下：94℃预变性4min；94℃ 30s.57℃退火1min，72℃1min30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃二保存。PCR的反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳（加荧光染料），在电压5V·cm^-1的条件下电泳1h，随后在Chalp Gel 5000凝胶电泳成像仪上观察并拍照分析。

1.2.4基因Ty-3和Rcm5.1共同扩增的PER反应体系与程序试剂的购买同上，PCR反应的体系为20μL，其中包括DNA模板2μL、10×buffer（含Mg²）2μL、正向引物（F）（10pmol·L）分另4 0，4μL共0.8μL、反向引物（R）（10 pmol·L^-1）分别0，4μL，共0.8μL、dNTPs（2.5mmol·L^-1）0，4μL、Taq DNA聚合酶（2.5 U·μL^-1）0，4μL、ddH₂O13.6μL。用购自北京奥赛博科技发展有限公司的2xTaql0 MasterMix来代替10xbuffer（含Mg²⁺）、dNTPs（2.5mmol·L^-1）和Taqase酶（2.5 U·μL^-1），最后所加试剂及其用量如下：DNA模板2μL、2×Taq10MasterMix10μL、正向引物（F）（10 pmol·L^-1）0.8μL、反向引物（R）（10 pmol.L^-1）0.8μL、ddH₂6.4μL。共同扩增Ty-3和Rcm5.1基因的PCR反应程序同上。PCR的反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳（加荧光染料），在电压5v·am^-1的条件下电泳1h，随后在Chalp Gel 5000凝胶电泳成像仪上观察并拍照分析。

2.结果与分析

2.1番茄黄化曲叶病毒病Ty-3基因的PCR扩增结果

根据Ji等人的报道，引物Ty-3F/Ty-3R是与番茄黄化曲叶病毒病紧密连锁的共显性标记，利用该标记对24份番茄材料进行单分子PCR扩增，检测番茄材料的基因型，11份番茄材料为Ty-3/Ty-3基因型，琼脂糖凝胶电泳均产生630bp的特异性片段，6份番茄材料为ty-3/ty-3基因型，琼脂糖凝胶电泳均产生320bp的特异性条带，7份番茄材料为Ty-3/ty-3基因型，琼脂糖凝胶电泳产生630 bp和320bd的特异性片段（图2）。该标记利用番茄相关的材料进行过多次检验，结果稳定可靠，可用于番茄抗黄化曲叶病毒病Ty-3基因的辅助选择。

2.2番茄溃疡病Rcm5.1QTL的PCR扩增结果

根据Coaker and Francis报道，与番茄溃疡病QTL位点Rcm5.1紧密连锁的标记是个显性标记。本研究利用了不同的番茄材料经过了大量的重复试验，结果稳定可靠。所以，利用引物可以准确地筛选含有番茄溃疡病抗病基因的材料。利用引物TG318F/TG318R对24份番茄材料进行单分子PCR扩增，检测番茄材料的基因型，结果供试的24份番茄材料通过琼脂糖凝胶电泳均产生580 bp的特异性抗病条带，没有感病条带（图3）。

2.3番茄黄化曲叶病毒病Ty-3基因和番茄溃疡病Rcm5.1QTL的PCR扩增结果

为了获得可以同时对番茄黄化曲叶病毒病和番茄溃疡病抗病基因筛选的PCR扩增反应体系，本研究在单引物稳定PCR扩增基础上，将引物TG318F/TG318R和Ty-3F/Ty-3R混合对24份番茄材料进行双分子PCR扩增，检测番茄材料的基因型，多重PCR结果为这2对引物扩增出来的特异性条带的叠加（图4）。由结果可以看出，无论是番茄黄化曲叶病毒病的纯合抗病、纯合感病或杂合抗病的基因型，还是番茄溃疡病的抗病基因型，通过PCR扩增均可扩增出原来单一引物所扩增的片段。经过大量的重复试验，结果稳定，能够准确地区分番茄材料的基因型。所以，本研究成功地建立了可以同时筛选番茄黄化曲叶病毒病Ty-3和番茄溃疡病QTL稳定的双基因PCR标记识别体系。

3.讨论

所谓的多重PCR是指在单一反应体系中加入一对以上的特异性引物，从而同时扩增多个序列的的反应过程，能够节省时间和精力。随着分子技术的迅速发展，利用分子标记辅助育种极大地加快了育种的进度。以番茄为模式植物的研究尤为深入，国内外已获得了多个与抗病基因紧密连锁的标记，这都为番茄分子辅助育种提供了有力的工具。目前多重PCR技术在番茄抗病育种中的应用主要有：黄化曲叶病毒病Ty-2基因和Ty-3基因、黄化曲叶病毒病Ty-1，基因和番茄根结线虫Mi基因、黄化曲叶病毒病Ty-1，基因和番茄叶霉病Cf-5基因、番茄叶霉病Cf-9基因和番茄烟草花叶病毒Tm-1基因、番茄斑萎病毒Sw-5基因和番茄根结线虫Mi基因、番茄花叶病毒Tm-22基因和番茄斑萎病毒Sw-5基因”、番茄花叶病毒Tm-22基因和番茄根结线虫Mi基因等。但是在番茄黄化曲叶病毒病和番茄溃疡病的多重PCR在番茄抗病育种中的应用未见报道，本研究基于前人的研究结果，开展了可以同时对番茄黄化曲叶病毒Ty-3基因和番茄溃疡病QTL进行筛选的双重PCR标记体系的建立。本研究在试验的过程中都进行了多次重复，结果完全一致，并且双引物PCR扩增结果为两对单引物扩增出来的特异性条带的叠加。本试验建立的多重PCR体系能够快速筛选和鉴定番茄抗黄化曲叶病毒病Ty-3基因和番茄溃疡病QTL位点，可省时、省力，大大降低成本，为番茄抗病基因的鉴定和辅助选择提供了有力的技术支撑。