复方金铃四逆四物失笑散颗粒质量标准研究

白春霞，冯 俭，蒋 川，宁海燕(.成都中医药大学，四川 成都 60072；2.成都中医药大学附属医院，四川 成都 60072)



复方金铃四逆四物失笑散颗粒质量标准研究

白春霞1，冯 俭2*，蒋 川1，宁海燕1
(1.成都中医药大学，四川 成都 610072；2.成都中医药大学附属医院，四川 成都 610072)

目的：建立复方金铃四逆四物失笑散颗粒的质量标准。方法：运用薄层层析法(TLC)对复方金铃四逆四物失笑散中的延胡索、白芍进行定性鉴别，采用高效液相色谱法(HPLC)测定复方中芍药苷含量，并进行定量分析。结果：TLC图谱显示斑点清晰，分离效果好。芍药苷在0.010 1～0.201 2mg· mL-1浓度范围内呈良好的线性关系(r=0.999 9)，专属性实验表明其他成分对芍药苷的测定无干扰，平均回收率及RSD均达到相应要求。结论：所建立的方法简便准确、专属性强、能有效控制该制剂的质量。

复方金铃四逆四物失笑散颗粒；薄层层析法；高效液相色谱法；延胡索；白芍；质量标准

复方金铃四逆四物失笑散颗粒简称复方失笑散颗粒,为我院名老中医针对原发性痛经实证病机“不通则痛”，而在古方基础上加减而得，主要由延胡索、白芍、枳壳、五灵脂等药材组成，具有理气活血、化瘀止痛之效。前期研究发现，该制剂对大鼠原发性痛经模型有明显的镇痛作用。为了有效控制该制剂质量，保证药物疗效，本实验结合《中国药典》2010年版相关药材项下的分析方法[2]，并查阅相关文献，明确复方中君臣药延胡索和白芍的薄层层析色谱(TLC)定性鉴别方法，并采用高效液相色谱法(HPLC)对复方中君药白芍中芍药苷活性成分进行含量测定，为复方失笑散颗粒质量标准的建立提供实验依据。

1 仪器与试药

Agilent LC 1260 型高效液相色谱仪；AS10300A 型超声清洗仪(天津奥特赛恩斯仪器)；HZT-A+200 型电子天平(福州华志科学仪器有限公司)；FW135 型中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。

芍药苷对照品(批号110736-201337)，延胡索乙素对照品(批号110726-201414)，均由中国食品药品检定研究院提供；复方失笑散颗粒由成都中医药大学附属医院制剂科提供；硅胶G(青岛海洋化工厂)；乙腈(Fisher)为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层层析鉴别

2.1.1 延胡索的薄层鉴别[1-2]称取复方失笑散颗粒3g，加入浓氨试液1mL和三氯甲烷20mL，摇匀，浸渍1h，时时振摇，过滤，滤液蒸干，残渣加2% 盐酸溶液10mL使其溶解，用乙醚提取2次，每次15mL，取水层，小心弃去乙醚层，用氨试液调至pH=9，乙醚提取2次，每次15mL合并乙醚液，蒸干，残渣加乙醇1mL使其溶解，作为供试品溶液。称取缺延胡索的复方失笑散颗粒3g，依供试品制备方法，同法制得阴性样品溶液。称取延胡索对照药材粉末0.2g，依供试品制备方法，同法制得对照药材溶液。另取延胡索乙素对照品，加乙醇制成0.5mg·mL-1的溶液，作为对照品溶液。分别取上述4种溶液各10μL，点于同一1 % NaOH溶液制备的硅胶G薄层板上，以正己烷-三氯甲烷-甲醇-二乙胺(20∶12∶1∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，置碘缸中约3min后取出，挥尽板上吸附的碘后，置紫外光灯(365nm)下检视。结果显示，供试品色谱在与对照药材和对照品相同的位置，显示相同颜色的荧光斑点，且阴性无干扰，见图1。

图1 复方失笑散颗粒中延胡索TLC图谱

2.1.2 白芍的薄层鉴别[2-4]称取复方失笑散颗粒2g，加入稀乙醇50mL，超声溶解20min，过滤，滤液蒸干，残渣加水20mL使其溶解，乙醚萃取2次，每次30mL，取水层，小心弃去乙醚层，用水饱和正丁醇萃取2次，每次30mL，合并正丁醇层，蒸干，残渣加乙醇1mL使溶解，作为供试品溶液。称取缺白芍复方失笑散颗粒2g，依供试品制备方法，同法制得阴性对照溶液。称取白芍对照药材粉末0.2g，依供试品制备方法，同法制得对照药材溶液。另取芍药苷对照品，加乙醇制成0.5mg·mL-1的溶液，作为对照品溶液。分别吸取上述4种溶液各10μL，点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(20∶3∶5∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，于105℃加热至斑点显色清晰，结果显示：供试品色谱在与对照药材和对照品相同的位置，显示相同的蓝紫色斑点，且阴性对照品无此斑点，见图2。

图2 复方失笑散颗粒中白芍TLC图谱

2.2 芍药苷含量测定[2,5-6]

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：乙腈-0.1%磷酸(15∶85)，流速：1mL·min-1，检测波长：230nm，柱温：30℃，进样量：10μL，理论塔板数不低于3 000，分离度R>1.5。

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取芍药苷对照品适量，置25mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.201 2mg· mL-1的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液制备 精密称取复方失笑散颗粒1.06g，置于50mL的量瓶中，加入35mL稀乙醇溶液，称定重量，超声30min，取出，放冷，称重，稀乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，滤液过0.45μm微孔滤膜，取续滤液即得。

2.2.4 阴性对照溶液制备 按处方比例称取除白芍以外的其他药材，同复方失笑散颗粒生产工艺制备阴性对照制剂，照“2.2.3”项下方法制备缺白芍阴性对照溶液。

2.2.5 线性范围考察 分别精密移取对照品溶液(浓度0.201 2mg·mL-1)0.5、1、2、3、5、7、10mL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀。分别吸取上述溶液各10μL注入高效液相色谱仪中，以峰面积为纵坐标，以芍药苷质量浓度(mg·mL-1)为横坐标绘制标准曲线，得线性回归方程为Y=14 896X+13.619，r=0.999 9(n=7)。结果表明：芍药苷在0.010 1～0.201 2mg·mL-1浓度范围内与其峰面积呈良好的线性关系。

2.2.6 专属性考察 按照上述色谱条件，分别精密移取芍药苷对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10μL注入高效液相色谱仪中，记录色谱图。结果显示：供试品色谱中与芍药苷对照品相同保留时间处出现色谱峰，阴性对照色谱中未出现该峰，表明其他成分对芍药苷的测定无干扰，见图3。

2.2.7 精密度试验 分别精密吸取芍药苷对照品溶液、复方失笑散颗粒供试品溶液各10μL，连续进样6次，记录每次的峰面积值。结果显示：芍药苷峰面积的RSD值分别为0.26%和0.32%(n=6)，表明仪器的精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 取同一批次复方失笑散颗粒(批号140618)，按“2.2.3”项下方法制备成供试品溶液，分别在0、4、10、16、24、36、48h精密吸取10μL注入高效液相色谱仪中，记录每次峰面积值。结果显示：芍药苷峰面积RSD=2.17%(n=7)，表面供试品溶液在48h内稳定性良好。

2.2.9 重复性试验 精密称取同一批复方失笑散颗粒(批号140618)粉末6份，分别按“2.2.3”项下方法制成供试品溶液，并按上述色谱条件进行HPLC分析，记录芍药苷峰面积值，计算含量。结果显示：样品中芍药苷平均含量为2.61mg·g-1，RSD= 1.04%(n=6)，表明芍药苷在该样品处理方法下重现性良好。

2.2.10 加样回收率试验 精密称取已知含量的复方失笑散颗粒(批号140618)6份，精密加入芍药苷对照品适量，按“2.2.3”项下方法分别制备成样品溶液，精密吸取10μL，注入高效液相色谱仪中，记录峰面积值，计算含量，测定芍药苷的加样回收率。结果显示：芍药苷平均加样回收率为99.02 %，RSD=0.90 %(n=6)，见表1。

图3 复方失笑散颗粒的HPLC色谱

表1 芍药苷加样回收率试验结果

2.2.11 样品含量测定 取不同批号的复方失笑散颗粒1.06g，精密称定，分别按“2.2.3”项下方法制成供试品溶液，每份样品平行3次，照上述色谱条件进行HPLC分析，记录色谱图，并计算供试品溶液中芍药苷含量。

表2 不同批号复方失笑散中芍药苷的含量测定结果 (n=3)

3 讨论

本实验采用TLC法和HPLC法对复方失笑散颗粒中君臣药分别进行定性鉴别和定量分析，为复方失笑散颗粒质量标准的建立提供了实验基础。

薄层层析鉴别实验中，对延胡索的薄层展开，分别考察了正己烷-三氯甲烷-甲醇-二乙胺(20∶12∶1∶0.2)、正己烷-三氯甲烷-甲醇-二乙胺(10∶6∶1∶0.1)、正己烷-三氯甲烷-甲醇(10∶6∶1)3个不同的展开系统，结果显示:以正己烷-三氯甲烷-甲醇-二乙胺(20∶12∶1∶0.2)展开时，斑点清晰，且斑点分离效果最好。白芍薄层鉴别中，分别考察了三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(20∶4∶5∶0.2)、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(20∶3∶5∶0.2)、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)3个展开系统，结果显示:以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(20∶3∶5∶0.2)为展开剂时，斑点分离清晰、无拖尾，展开效果最好。在芍药苷HPLC含量测定实验中，分别对提取溶媒(甲醇、水、70%乙醇、稀乙醇)、提取方式(超声30min、超声1h、回流30min、回流1h)进行考察，结果发现：稀乙醇的提取率均明显高于甲醇、水和70%乙醇;超声法的提取效果较回流法好，超声提取30min所得芍药苷含量高于超声提取1h，表明超声提取时间与含量不呈正相关。此外，对流动相也进行了考察，分别按照乙腈-水(15∶85)、甲醇-0.1%磷酸水(15∶85)、乙腈-0.1%磷酸水(15∶85)、乙腈-0.1%磷酸水(14∶86)、乙腈-0.1%磷酸水(12∶88)进行洗脱进样，结果发现：在乙腈-0.1%磷酸水(15∶85)的条件下，芍药苷理论塔板数最高，且不低于3 000，分离度也最好，分离度和拖尾因子均符合2010年版《中国药典》附录规定。

[1] 曹玲,冯有龙,王亚超,等.骨刺片的质量标准研究[J].中国药品标准,2011,12(3):191-195.

[2] 国家药典委员会.中国药典[S].北京:化学工业出版社,2010.

[3] 李瑞丽,王喜民,张玉东.薄层色谱法鉴别胃康灵胶囊中白芍、三七和延胡索[J].亚太传统医药,2013,9(3):19-20.

[4] 张艳,田其学,袁清照.复方胆宁片质量标准研究[J].湖南中医杂志,2012,28(1):100-101.

[5] 席小兰,冯俭,谢玉,等.高效液相色谱测定养血愈风颗粒中芍药苷含量[J].中国中医药信息杂志,2013,20(2):55-56.

[6] 李聘婷,陈子骄,贾薇,等.中药胶囊剂中芍药苷含量测定方法优化[J].时珍国医国药,2014,25(10):2357-2359.

(责任编辑：宋勇刚)

Study on Quality Standard of Fufang Jinlingsinisiwushixiao GranuLe

Bai Chunxia1，Feng Jian2*，Jiang Chuan1，Ning Haiyan1
(1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Sichuan 610072,China;2.Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Sichuan 610072,China)

Objective:To establish the quality standard of Fufang Jinlingsinisiwushixiao GranuLe(FSXG).Methods:Rhizoma Corydalls and Radix Paeoniae Alba were qualitatively identified by TLC.The content of Paeoniflorin in FSXG was determinated and analyzed by HPLC.Results:TLC showed that the points were clear and the separation effect was good.There was a good linear relationship at the range of 0.010 1～0.201 2mg·mL-1for Paeoniflorin (r=0.999 9).Specificity experiment showed that other ingredients without interference to the determination of Paeoniflorin.The average recoveries and RSD were up to the requirement.Conclusion:The established methods were simple and accurate with good reproducibility which can control the quality of this preparation effectively.

Fufang Jinlingsinisiwushixiao GranuLe; TLC; HPLC;RhizomaCorydalls;RadixPaeoniaeAlba;Quality Standard

2014-01-06

白春霞(1988-)，女，成都中医药大学硕士研究生，研究方向为中药化学成分分析和中药质量标准。

冯俭(1963-)，男，成都中医药大学教授，硕士生导师，研究方向为中药化学成分分析和中药制剂研发。

R284

A

1673-2197(2015)11-0042-03

10.11954/ytctyy.201511017