冬虫夏草中主要核苷类成分测定

朱 秋

(驻马店市第一中医院，河南 驻马店 46300)



冬虫夏草中主要核苷类成分测定

朱 秋

(驻马店市第一中医院，河南 驻马店 46300)

目的：通过使用灵敏、可靠的液相色谱-质谱联合同时进行分离和电喷雾电离质谱的方法(LC/ESI-MS)检测冬虫夏草中胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷和虫草素。开发新的检测冬虫夏草中主要核苷类成分的方法。方法：使用液相色谱-质谱联合同时进行分离和电喷雾电离质谱的方法(LC/ESI-MS)，检测冬虫夏草中胸腺嘧啶，腺嘌呤，腺苷和虫草素。结果：该方法成功用于同时检测冬虫夏草中核苷的成分。结论：LC/ESI-MS方法在中药活性成分的分析是一种非常有效的技术。

冬虫夏草；核苷类；LC/ESI-MS

冬虫夏草在我国传统中医学主要用于治疗高血糖症，呼吸疾病和肝脏疾病，及肾功能不全、肾功能衰竭等[1]。核苷是冬虫夏草中非常重要的质量控制指标[2]。目前有几种技术可用于冬虫夏草中主要核苷的分析，如薄层色谱法(TLC)[3]、高效液相色谱(HPLC)[4]和毛细管电泳[5]。然而，这些方法通常可确定只有一个或两个相对含量较高的核苷，而对于一些相对微量的核苷检测并不是特别灵敏，但是这些微量核苷也是冬虫夏草质量重要判定指标。本研究开发了一个简单和可靠的液相色谱(LC)-mass光谱检测器(MS)联合电喷雾离子化(ESI)方法，同时进行分离和测定该类核苷。

1 仪器

质谱仪LCMS-2010，液相色谱系统，VP-ODS(2.0mm×150mm)(岛津，京都，日本)，DGU-14A脱气机。C18Guard-pak cartridge(沃特斯，米尔福德，MA，USA)。通过资料和验证，设定[M+H]+ions 的m/z值在127，136，268，252和302。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备

精密称取各标样10mg，分别置于10mL量瓶中，用25%甲醇精确定容。精密称取各待测样本0.1g，置于10mL试管中，分别使用回流法、研磨和超声法提取，取5mL上清液，再用25%甲醇定容至刻度。

2.2 色谱条件优化

在使用LC/ESI-MS法时，流动相的选择应考虑分析物分离后并产生电离的影响。对于核苷从虫草和其类似物中的分离，一些报道已经指出使用梯度洗脱的流动相，包括KH2PO4缓冲液和甲醇，但由于低挥发性和高盐浓度，这种溶剂系统不适合于LC/ESI-MS分析。因此，醋酸铵被选择用于控制移动相的酸度。用乙酸铵和甲醇作为流动相和梯度洗脱程序，使得四个主要核苷可成功被分开。

2.3 标准曲线建立

每组七个非零点校准样，1.0～117.5μg/mL为胸腺嘧啶，1.8～127.0μg/mL为腺嘌呤，0.6～114.0μg/mL为腺苷和0.5～107.5μg/mL为虫草素作为计算标准曲线。校准曲线是通过绘制每种分析物的峰面积比(Y)的计算，并在LC/ESI-MS对浓度(X,μg/mL)每个标准物一式三份进行分析，浓度为10μg/mL。

表1 主要核苷类类线性方程

2.4 线性关系考察

通过以上的方程，得知由于胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、虫草素都存在于冬虫夏草提取物，事实上并不存在所谓的真正的空白对照。因此使用溶剂作为空白对照进行了分析，结果证明在m/z为127、136、268、252和302数值下没有检测到任何峰值，因此，在各个样本加入浓度分别为2、20、100μg/mL时，胸腺嘧啶测出值分别为：2.06、19.7、101.6；腺嘌呤测出值分别为：1.96、20.7、99.3；腺苷测出值分别为：1.96、20.3、99.6；虫草素测出值分别为：2.08、20.04、99.3。通过以上结果得知，相关性R在0.998 9～0.999 1之间，说明了不同浓度的分析数据保持了非常良好的线性关系。

2.5 精密度实验

通过6次重复进样测试，计算各个峰值的面积RSD值分别为0.64%、0.51%、0.27%和0.47%，与同类型的文献数据结果基本一致，表明该方法精密度良好。

2.6 稳定性测试

在0、2、4、6、8、12、24h时间点进样测定各组分的含量，结果表明以上各个时间点的样本在数据上无明显差异，表明RSD的值分别为1.04%、2.00%、1.75%和1.42%，验证了有效成分在24h内稳定。

2.7 样品回收率测试

取以上样本，每份约10mg，加入胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、虫草素的标准样本混合溶液5mL，各有效成分的回收率分别如下：胸腺嘧啶为99.40%，腺嘌呤为98.98%，腺苷为99.27%，虫草素为98.20%，结果可靠、稳定。

3 讨论

冬虫夏草由于产量有限，需求量高，因此目前市场上存在大量的假冒伪劣产品，并且常规方法很难辨别，而一般的测定方法，均有其局限性，如常规的HPLC、凝胶电泳法等只能测定其中一到两种主要核苷，而对于相对微量的核苷则不敏感[1-3]。由于常规的冬虫夏草定量分析需要0.3～0.6g样本，单株的冬虫夏草一般很难达到要求，而本研究中，冬虫夏草的用量可以控制在0.1g以内，大大减少了材料的需求，同时也能够达到单株间比较的目的。考虑到核苷是水溶性的，因此在提取时不能使用常规的方法进行提取，本实验选择甲醇作为溶剂，同时，甲醇浓度的梯度实验验证了25%的浓度得率最高。

另外，在样本的初步提取方面，比较了三种不同的方法，包括细胞研磨、回流提取和超声破碎，由于虫草与其他孢子类菌不同，子坐和虫体都比较难研磨，因此选择回流提取。通过使用梯度洗脱系统和2-氯腺苷为内参，找到了适合的LC/ESI-MS的方法来检测冬虫夏草中的四个主要核苷，方法包括分离和测定，并且通过了最终的验证。目前在虫草的成分分析上，HPLC和凝胶电泳是比较常规的检测方法，但是单纯使用一种分析方法往往只能检测到其中的几种核苷成分，本研究通过仪器上的联用和方法学上的改进，新的模型可用于快速准确地鉴定虫草材料中核苷的含量差异，尤其是通过仪器的联用，达到了对多个不同属性以及较难检测核苷的检测。而在常规方法的检测中，常常会遇到检测不到鸟嘌呤、胸腺嘧啶和虫草素等情况。使用LC/ESI-MS联用的手段解决了以上的难题，由于可以检测多种不同的核苷，这也帮助我们发现了来源、产地、储存时间和条件等不同，样本中的核苷含量也有所不同，为以后进一步的研究奠定了基础。因此，本研究结果表明，使用LC/ESI-MS方法在中药活性成分的分析中是一种非常有效的技术。

[1] 梁洪卉，程舟，杨晓伶，等. HPLC定量分析冬虫夏草的主要核苷类有效成分[J].中药材，2008，31(1)：25.

[2] 李绍平，李萍.季晖，等.毛细管电泳法测定冬虫夏草中核苷类的含量[J].药物分析杂志，2001，21(2)：71.

[3] 陈作红，田向荣，孟祥贤，等.古尼虫草核苷类成分的高效液相色谱分析[J].菌物系统，2003,22(3):489-493.

[4] 丁婷，胡丰林，耿德贵，等.冬虫夏草及其无性型菌株发酵液中核苷类成分的HPLC法定量分析[J].食品与发酵工业，2006，32(6):97-99.

[5] 钱正明，周妙霞，孙敏甜，等.冬虫夏草不同部位核苷类成分比较分析[J].世界科学技术—中医药现代化,2014(11)：58.

(责任编辑：魏 晓)

2015-04-30

朱秋(1972-)，男，河南省驻马店市第一中医院主管中药师，研究方向为中药鉴别及制剂深加工。

R284

A

1673-2197(2015)17-0028-02

10.11954/ytctyy.201517014